研究背景和目的原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)在临床上恶性程度较高,是影响人类健康的重大疾病之一。我国是世界上肝癌高发区之一,发病率为20.37/10万,位于常见肿瘤的第3位。每年全球肝癌的新发病人数有65万左右,其中一半以上发生在我们国家。而在亚洲,我们占了每年新发病人数的80%以上。虽然目前临床上可用于治疗肝癌的手段比较多,包括手术切除、肝移植、血管介入、消融技术、放化疗等,且在肝癌的药物治疗上取得重大突破,但手术切除仍被公认为肝癌获得根治的最好手段。然而,即使是根治性切除,5年内仍有60-70%的病人出现转移复发,而局部治疗的转移复发率更高。如何预防肿瘤转移复发已成为提高肝癌患者生存率的关键。因此,寻找预测肿瘤转移倾向、判断肿瘤预后的标志物,探索预防和治疗的有效途径,从而降低死亡率,提高肝癌患者的5年生存率,这是肝癌研究的重点内容,也是肿瘤防治研究中的一个难点。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3)是硫酸乙酰肝素糖蛋白(Heparan sulfate proteoglycan, HSPG)家族中的一员,是由蛋白质、脂质和糖三者共价连接的复杂糖复合物,广泛存在于细胞表面,通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上。glypican-3又称GPC3、MXR7、OCI-5、GTXR2-2,基因片段全长大于900kb,是人类基因组中最大的基因之一。目前认为GPC3的HS链与大量生物效应分子(如生长因子及其受体、细胞外基质蛋白和粘附分子等)相互作用,从而调节细胞增殖、分化、粘附和迁移等,还可能参与抑制或调节大部分中胚层组织和器官的生长。有研究发现,GPC3参与Wnt、Hedgehog (Hh)、FGF、IGF、BMP、 SMAD、TGF-β等多个与肿瘤发生发展密切相关的信号通路的调节；GPC3在肝细胞癌、大肠癌、恶性黑色素瘤、Wilm’s瘤、成神经细胞瘤和肝胚细胞瘤高表达,而在肺腺癌、卵巢癌、乳腺癌、间皮瘤中表达显著下调,提示GPC3在肿瘤的发生发展中起着重要的作用,并且在不同的肿瘤中可能发挥的作用不同。据研究,GPC3在人类肝癌组织中有显著的表达,与肝癌的发生发展关系十分密切。Notch信号转导通路由一组在进化上高度保守的细胞膜配体、受体及下游分子组成。哺乳动物中存在4种Notch受体(Notchl-4)以及5种配体。Notch信号转导过程主要发生在细胞间,故Notch受体是由异二聚体组成的单跨膜分子,其配体同样为跨膜分子。目前已发现的4种Notch受体的主要区别在于EGF重复序列。Notch受体在作为受体的同时,也作为转录因子发挥巨大的作用。细胞间受体配体作用可激活Notch信号转导过程,从而直接调节基因转录,使细胞基因表达受相邻细胞调控。Notch信号在细胞分化、胚胎发育、组织自我更新过程中均发挥了重要的作用,许多病理过程(包括肿瘤)都有Notch信号参与。Notch信号多作为癌基因促进肿瘤生长,但在某些组织也可起到诱导细胞分化、抑制肿瘤增殖的作用。肿瘤干细胞中Notch信号的改变可能发挥了关键性作用。有研究观察到Notch1信号可能导致肝癌细胞周期停滞和凋亡,在肝癌中主要发挥抑癌基因的作用,与肝癌的发生发展关系密切。本课题的研究目的是通过检测GPC3及Notch1在肝癌细胞株中的表达情况,然后改变肝癌细胞中GPC3的表达水平观察Notchl表达水平的变化,最后从组织水平验证GPC3及Notch1在肝细胞癌组织中的表达情况,从而来探讨GPC3与Notch1两者在肝细胞癌中的相互关系,为深入研究肝细胞癌的分子靶向治疗靶点奠定理论基础。方法1.GPC3和Notch1在肝癌细胞株中表达情况的检测采用荧光定量RT-PCR的方法检测MHCC97-H、SMMC-7721、HepG2、QGY-7701和Bel-7402等5种肝癌细胞株中GPC3mRNA和Notchl mRNA的表达情况,然后用Western blotting检测这5种肝癌细胞株中GPC3和Notchl的蛋白表达水平。2.构建干扰GPC3表达的重组质粒DNA根据GPC3基因的相关信息(序列、序列号等),设计了4条shRNA序列(包括GPC3-809-shRNA、GPC3-1246-shRNA、GPC3-1720-shRNA GPC3-715-shRNA);然后按设计好的shRNA序列设计、合成两条互补的短片段的DNA；对合成好的DNA片段进行稀释、退火,连接到线形化处理过的pGPU6/GFP/Neo载体,转化,涂平板,过夜培养,筛选阳性菌落进行测序。3.瞬时转染MHCC97-H和SMMC-7721肝癌细胞株,观察干扰GPC3表达后Notch1表达水平的变化情况采用脂质体转染技术将构建好的质粒做转染实验,筛选出一条最有效的shRNA序列；然后用筛选出的高效重组质粒转染MHCC97-H和SMMC-7721肝癌细胞株,转染48小时后利用荧光定量RT-PCR和Western blotting方法检测GPC3和Notch1的表达情况,从而观察干扰GPC3表达后Notch1表达水平的变化。4.GPC3和Notch1在肝细胞癌组织中表达情况的鉴定应用免疫组化方法、计算机图像分析等技术检测30例肝细胞癌组织中GPC3和Notch1的表达情况。5.统计学方法应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。计数资料用Nonparametric Test;计量资料用Compare Means中的Independent-Samples T Test和One-Way ANOVA;相关性分析采用Bivariate。P<0.05表示差异有统计学意义,检验水准为a=0.05,采用双侧性检验。结果1.GPC3和Notch1在肝癌细胞株中的表达情况荧光定量RT-PCR结果显示,在MHCC97-H、SMMC-7721、HepG2、QGY-7701和Bel-7402等5种肝癌细胞株中GPC3的表达差异具有显著性(F=112.516, P=0.000), Notch1的表达差异也具有显著性(F=123.793,P=0.000)。运用2-△△Ct法,以QGY-7701细胞为对照,结果发现在Bel-7402、QGY-7701、HepG2、 SMMC-7721和MHCC97-H等5种肝癌细胞株中GPC3的表达依次升高(P<0.05),而Notch1的表达依次降低(P<0.05)。Western blotting结果显示,在Bel-7402、QGY-7701、HepG2、SMMC-7721和MHCC97-H等5种肝癌细胞株中GPC3的蛋白表达水平依次升高,Notch1的蛋白表达水平依次降低。2.4条shRNA序列的筛选将按设计的4条shRNA序列构建的干扰GPC3表达的4个质粒及阴性对照质粒(NC-shRNA)转染MHCC97-H细胞,转染48h后在荧光显微镜下观察,计算转染效率：GPC3-809-shRNA组为82.5%,GPC3-1246-shRNA组为55.7%, GPC3-1720-shRNA组为47.3%, GPC3-715-shRNA组为76.2%,NC-shRNA组为79.6%。对于以上5组转染后的MHCC97-H细胞,荧光定量RT-PCR结果显示,GPC3的表达差异具有显著性(F=63.871,P=0.000),其中GPC3-809-shRNA组的GPC3表达水平最低(P<0.05); Western blotting结果也显示GPC3-809-shRNA组的GPC3表达水平最低。综上得出,GPC3-809-shRNA组的转染效率最高,干扰效率也最高。3.干扰GPC3表达后Notch1表达水平的变化用GPC3-809-shRNA组和NC-shRNA组质粒分别转染MHCC97-H、 SMMC-7721肝癌细胞,转染48h后,荧光定量RT-PCR结果显示,GPC3-809-shRNA组MHCC97-H细胞的GPC3表达水平为NC-shRNA组MHCC97-H细胞的0.281±0.081(t=6.221, P=0.003); GPC3-809-shRNA组MHCC97-H细胞的Notchl表达水平为NC-shRNA组MHCC97-H细胞的5.243±0.308(t=13.636, P=0.000); GPC3-809-shRNA组SMMC-7721细胞的GPC3表达水平为NC-shRNA组SMMC-7721细胞的0.427±0.110(t=5.645, P=0.005); GPC3-809-shRNA组SMMC-7721细胞的Notch1表达水平为NC-shRNA组SMMC-7721细胞的3.782±0.200(t=10.605, P=0.008)。Western blotting结果显示,对于转染后的MHCC97-H和SMMC-7721细胞,GPC3-809-shRNA组的GPC3蛋白表达水平均低于NC-shRNA组,而GPC3-809-shRNA组的Notchl蛋白表达水平均高于NC-shRNA组。4.GPC3和Notch1在肝细胞癌组织中的表达情况免疫组化的半定量和定量描述结果均显示,在高分化、中分化和低分化的肝细胞癌组织中,GPC3的表达水平依次升高,差异有显著性(P<0.05)或高度显著性(P<0.01); Notch1的表达水平依次降低,差异有显著性(P<0.05)或高度显著性(P<0.01)。半定量描述结果的Spearman法等级相关分析表明,GPC3与Notch1之间的表达呈高度显著性负相关(rp=-0.607,P=0.000)；定量描述结果的Pearson法相关分析也表明,GPC3与Notchl之间的表达呈高度显著性负相关(r=-0.692,P=-0.000)。结论1.在Bel-7402、QGY-7701、HepG2、SMMC-7721和MHCC97-H等5种肝癌细胞株中GPC3的表达水平依次升高,Notch1的表达水平依次降低,GPC3与Notch1在这5种肝癌细胞株中的表达水平相反。2.应用RNAi技术,将靶向GPC3基因的shRNA转染肝癌细胞,能成功介导GPC3基因沉默,达到靶向封闭GPC3基因的目的。在设计的4个shRNA序列中,以GPC3-809-shRNA序列的转染效率最高,靶向GPC3的干扰效率最高。实验结果显示,沉默GPC3基因的表达后,Notch1基因的表达水平发生了变化,其表达水平上调。提示GPC3与Notch1之间可能存在负性的相互调节机制。3.肝细胞癌组织分化程度越高,GPC3的表达越低,Notch1的表达越高；分化程度越低,GPC3的表达越高,Notch1的表达越低。GPC3与Notch1在肝细胞癌组织中的表达水平呈现显著性负相关,从组织水平验证了GPC3与Notch1之间的相互关系。