背景：登革病毒(Dengue virus，DEN)属黄病毒科蚊媒病毒，有4个血清型，可引起人类登革热(dengue fever，DF)、登革出血热(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome，DSS)。据报导，目前全球约25亿人口受到登革病毒感染的威胁[1]。 DHF/DSS最明显的特征是血浆渗漏和全身出血，提示血管的病变与疾病的严重程度密切相关。但DHF/DSS发病机制尚未完全清楚，尤其是血管渗漏综合症有关的内皮细胞功能损伤的发牛机制不明。早期的研究认为，抗体依赖增强作用(ADE)是第二次异源性登革病毒感染诱发DHF/DSS的主要原因[2-4]；而病毒的变异也与登革感染的严重程度有关[5-7]；有报道认为，登革病毒的直接作用以及登革病毒感染引起的免疫病理损伤参与了致病[8-10]；而目前越来越多的证据表明登革病毒感染诱导的宿主细胞凋亡可能在DHF/DSS中起着重要的作用[11-13]。 病毒感染可导致宿主靶细胞凋亡，死亡受体(death receptors，DRs)介导的途径是一条重要的凋亡调控途径。DRs，属于肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)受体超家族，是Ⅰ型膜蛋白，具有一个富含半胱氨酸的胞外结构域和一个同源的胞浆序列-死亡结构域(Death Domain，DD)。DRs结合同源配体后，通过DD募集其下游诱导凋亡的效应分子，引起一系列Caspase的活化，从而引起凋亡[14]。目前与病毒感染密切相关的DRs主要包括Fas(CD95)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、TNF相关诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)受体TRAILR。 Fas(CD95)是FasL的受体，机体中许多组织细胞都可表达[15]。配体化的Fas能通过其DD与细胞内的转接蛋白FADD(Fas-associated death domain protein)相互作用。FADD通过死亡效应区(Death Effector Domain，DED)与procaspase-8结合，形成死亡诱导信号复合物(DISC，death-inducing signaling complex)，它能导致procaspase-8蛋白水解并自我激活。caspase-8的活化又能引发caspase激活的级联反应，激活caspase-3等效应分子，导致细胞核的形态变化，引起细胞凋亡。Fas介导的凋亡在CTL杀病毒感染的细胞、去除激活的T细胞及药物治疗肿瘤过程中发挥了重要的作用。有报道[16-19]，由Fas介导的细胞凋亡在脉管系统牛理或病理性的细胞更新过程中发挥了一定的作用。另据报道[20]，Fas系统参与了暴发性乙型肝炎的发病。 TRAIL能诱导大多数肿瘤细胞凋亡，在病毒与宿主细胞相瓦作用中也起着重要的作用[21-24]。TRAIL受体包括5种，其中两种死亡受体——RAILR1(DR4)、TRAILR2(DR5)，能诱导多数肿瘤细胞或转化细胞凋亡；两种“诱骗”受体(decoy receptor)——TRAILR3(DcR1)、TRAILR4(DcR2)，由于缺乏胞浆内完整的DD，不能介导凋亡，正常细胞通过这两种受体与TRAILR1和TRAILR2竞争结合TRAIL而免受凋亡；一种可溶性的受体——OPG(osteoproteoprotegerin)，能清除体内的TRAIL。TRAIL的致凋亡作用与细胞表面的TRAIL死亡受体(TRAILR1、TRAILR2)的高表达及TRAIL诱誀受体(TRAILR3、TRAILR4)的低表达有关。越来越多的研究表明：TRAIL受体介导的细胞凋亡与病毒感染有关[25-26]。据Matsuda的报道[27]：登革病毒感染诱导肝细胞凋亡的实验中，TRAIL/TRAILR是一对重要的凋亡媒介分子。 TNFR主要包括TNFR1和TNFR2，也可参与细胞凋亡调控途径[28]，其配体主要是感染活化的巨噬细胞和T细胞产生的TNF-α[29]。TNFR1和TNFR2的生物学功能不是独立的，许多牛物学活性由两者共同完成。 登革病毒可以损伤人类不同组织的血管内皮细胞(vessel endothelial cells，VECs)[30]，但登革病毒对VECs凋亡的影响及可能的凋亡通路尚未有确切报道。由于目前尚无理想的登革病毒损伤血管内皮的动物模型，体外实验就成为探讨DHF/DSS中血管内皮细胞损伤机制的重要途径。本实验用了三种不同来源的VECs来研究登革病毒对血管内皮细胞的致凋亡作用，比较其DRs的表达，并进一步检测凋亡信号转导通路中caspase系列凋亡相关蛋白的变化，这有助于进一步揭示登革病毒感染致宿主细胞凋亡的分子机制，并为DHF/DSS中血浆渗漏和出血的发病机制提供一定的参考依据。目的本研究旨在明确参与DEN-2引发血管内皮细胞凋亡的DRs及其凋亡信号转导通路。 方法 (1)DEN-2的扩增与定量：采用C6/36细胞进行病毒扩增，病毒蚀斑实验定量。 (2)人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304)、人肝静脉血管内皮细胞株(ED25)的培养：常规贴壁细胞培养法。 (3)原代分离的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)细胞分离、培养、鉴定：取新鲜脐带分离、培养原代HUVEC。采用形态学、Ⅷ因子抗原免疫组织化学技术鉴定所分离的细胞。用生长稳定，形态良好的第二至第四代细胞进行试验。 (4)细胞凋亡实验：用Annexin-V-FITC和7-ADD(7-氨基放线菌素D)标记，流式细胞技术(FACS)检测细胞凋亡。 (5)DRs及FasL的检测：用单克隆抗体对细胞进行表面标记染色，FACS技术检测病毒作用前、后血管内皮细胞DRs及FasL的表达。 (6)凋亡阻断实验：在DEN-2感染细胞的同时，加入caspase阻断剂与细胞共培养，检测阻断后细胞凋亡百分比的变化。 (7)Western Blot：免疫印迹法检测DEN-2感染前、后细胞内活化caspase-8和caspase-3的变化。 (8)统计方法：实验结果采用SAS 8.1软件进行数据统计和分析。 结果 (1)DEN-2感染后ECV304、ED25两株细胞细胞凋亡数及细胞表达Fas百分比均增加(P<0.05)；而TRAILR1-4，TNFR1-2表达水平甚低，且感染前、后无明显改变。 (2)DEN-2感染后HUVEC细胞凋亡数增加，凋亡的数量随时间的延长而有增高趋势；但在同一时间、不同滴度(m．o．i．=0.04，0.4，4，40)的DEN-2感染HUVEC，凋亡数未见明显差别。 (3)DEN-2感染后HUVEC细胞表达Fas百分比增加，P<0.05；HUVEC的TRAILR1、TNFR1-2表达水平甚低，且感染前、后无明显改变；TRAILR2-4有表达(10％-28％)，感染后呈降低趋势。 (4)HUVEC细胞表达FasL百分比为7.5％-11.5％，DEN-2感染前、后无明显差别。 (5)DEN-2感染后，caspase3、6、8、9阻断剂能一定程度降低HUVEC的凋亡百分比。 (6)Western Blot结果观察到DEN-2感染后，HUVEC出现磷酸化的caspase8和caspase 3条带。 结论 (1)DEN-2能诱导血管内皮细胞ECV304、ED25、HUVEC产生细胞凋亡。 (2)DEN-2感染前，ECV304、ED25两细胞系与新鲜分离的原代HUVEC细胞表达DRs不一致。 (3)DEN-2感染后，三种VECs(ECV304、ED25、HUVEC)细胞表达Fas百分比均显著高于感染前。 (4)TRAILR1-4、TNFR1-2在DEN-2体外感染VECs诱导凋亡中未见明显作用。 (5)HUVEC细胞表面表达FasL。 (6)DEN-2感染VECs，Fas与FasL结合并激活caspase的信号转导通路可能是DEN-2感染诱发血管内皮细胞凋亡的重要机制之一。