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目的:骨和关节软骨缺损的修复迄今尚未有一种理想的方法,而对前者的研究较多,对软骨缺损的研究相对较少。临床治疗关节软骨缺损常用软骨成形术、骨髓刺激术等,由于修复的软骨成分以纤维软骨为多、短期效果尚可、但长期随访效果欠佳。间充质干细胞的多方向分化潜能,一直是软骨修复研究的热点,但是对间充质干细胞软骨分化后的问题仍存在着的争论。多能干细胞也用于软骨缺损的修复,由于涉及伦理道德问题及长期使用发生肿瘤的风险,也阻碍了多能干细胞的进一步研究。支架材料同样是研究的热点,特别是天然材料,如水凝胶、胶原等,但存在植入体内后机械强度差,降解时间难以控制等问题;人工合成高分子材料,如聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA),有容易出现局部酸中毒、过量加热引起单体链解聚等问题;羟磷灰石等生物材料由于脆性大、塑性困难,较少用于软骨修复中。组织工程方法特别是模仿自然软骨形成步骤的方法目前是研究的热点,但是对软骨的构建离临床的应用尚有很长一段距离。正是基于目前关节软骨缺损的修复尚无“金标准”的情况下,本实验希望能寻找到更理想的材料和方法,除了能够通过实验证明制备的材料对骨组织工程的应用可行性外,最主要的是希望材料能促进关节软骨缺损的修复,为未来临床的应用夯实基础,这是本论文研究的目的和出发点。方法:1.制备骨形态发生蛋白(BMP-2)与磷脂复合物:BMP-2与磷脂按照不同的比例,溶解在有机化学溶剂中,经过冷冻干燥形成复合物。2.采用溶液浇铸法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、骨形态发生蛋白(BMP-2)和磷脂的复合物膜。3.检测复合物的理化特征,包括:BMP-2的包封率、复合材料的静态接触角、吸水率、扫描电镜下的形态、能量色谱仪分析等等,并对材料的BMP-2体外释放能力通过透析法进行测定。4.PLGA-BMP-2-磷脂复合物与OCT-1成骨样细胞联合培养,通过细胞粘附试验、细胞增殖试验、免疫组织化学分析、细胞碱性磷酸酶测定、实时定量荧光PCR分析等方法了解并比较制备的复合缓释材料对细胞粘附、增殖、分化特别是长期生长的影响。5.制备新西兰大白兔膝关节软骨缺损实验动物模型,将制备的复合物植入软骨模型内,通过大体标本、组织学染色、核磁共振扫描等方法观察并比较植入物修复关节软骨缺损情况。结果:1.PLGA-BMP-2-磷脂复合物的包封率、静态接触角、吸水性、扫描电镜形态及体外释放试验结果均明显优于试验对照(PLGA-BMP-2)。特别是BMP-2的体外释放,实验组在长达30天观察中仍有BMP-2表达,而对照组的释放时间主要集中在开始释放的最初3天。2.PLGA-BMP-2-磷脂复合物与细胞联合培养结果显示:实验组促进了细胞的粘附与增殖,特别是长时间(7天)观察,实验组对细胞增殖的促进作用更加明显(p<0.01);对细胞免疫组化分析显示实验组能够提高OCT-1细胞的Ⅰ型胶原表达;实验组在长期观察中(15天)显示出对细胞碱性磷酸酶活性有更强的影响,与对照组有显著的差异(p<0.01);同样在长期观察中(15天),通过RT-PCR测定OCT-1细胞的成骨相关基因:骨钙素(OCN)、胶原蛋白(COL)、骨桥蛋白(OPN)、RUNT相关转录因子2(RUNX2)的表达,均显示实验组与对照组有显著性差异(p<0.01),实验组明显上调了这些基因表达。3.动物关节软骨缺损的体内修复实验结果显示在2周、4周、8周、12周,经过大体标本观察、组织学检查、MRI检查均显示出实验组修复软骨缺损的能力更强。特别是经过长时期观察(8周、12周),实验组与对照组之间比较有显著性差异(p<0.01)。结论:1.磷脂增强了PLGA与BMP-2的结合能力,解决了既往PLGA/BMP-2复合物中BMP-2释放过快的问题,证明了PLGA-BMP-2-磷脂复合物能够达到BMP-2缓释的目的。2.PLGA-BMP-2-磷脂复合物体外实验证实复合物能够促进OCT-1细胞的粘附、增殖,分化;尤其是对成骨细胞的长期增殖分化有明显影响,证明了PLGA-BMP-2-磷脂复合物有更强的BMP-2缓释能力,有能力应用于骨组织工程。3.PLGA-BMP-2-磷脂复合物植入动物关节缺损模型体内后能够促进关节软骨缺损的修复,实验组效果优于对照组,证实了实验组中BMP-2对软骨修复有缓释作用及动物体内植入复合物的可行性。4.PLGA-BMP-2-磷脂复合物能够为软骨的修复提供一种新颖的复合生物材料。