石灰性土壤溶磷细菌的筛选鉴定及在复垦土壤上的应用

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本文在山西石灰性土壤上筛选溶磷细菌,并将其应用在采煤塌陷复垦土壤上,主要结论如下:1.利用磷细菌选择性培养基对山西省10个地市44个县区的440个土样进行分离筛选,初步筛选出溶磷细菌147株,将147株溶磷细菌分别接种在磷酸三钙液体培养基中,进一步筛选出溶磷量大于200mg/L的细菌25株,经过5次纯化后,有12株溶磷能力显著下降或丧失溶磷能力,最终筛选出遗传性稳定且在磷酸三钙液体培养基中溶磷量仍大于200mg/L的细菌13株;通过形态观察、生理生化鉴定结合16sRAN测序结果对13株溶磷细菌进行了鉴定,其中7株属于肠杆菌(Enterobacter sp);3株属于拉恩式菌(Rahnella); 1株属于蜡样芽胞杆菌(Waxy bacillus);2株属于荧光假单胞菌(Fluorescent pseudomonas)。13株溶磷细菌在磷酸三钙液体培养基中的溶磷量为296.5mg/L-563.5mg/L,在磷矿粉液体培养基中的溶磷能力在5.35mg/L-18.49mg/L,在磷酸铁液体培养基中的溶磷量为38.33mg/L-173.63mg/L,在磷酸铝液体培养基中的溶磷量为32.03 mg/L-72.07mg/L2.溶磷拉恩氏菌W25在磷酸三钙、磷酸铝、磷酸铁培养液中有效磷含量最大值分别为403.4、110.4、216.6mg/L,培养液有效磷含量与培养液pH变化之间的均呈现显著相关(p<0.05);拉恩式菌W25在培养第2-4d具有较强的缓冲能力,从第5d开始,拉恩式菌W25缓冲能力开始减弱,菌株在7d后基本丧失了缓冲能力;拉恩式菌W25以葡萄糖为碳源以硝酸铵为氮源时对磷酸三钙的溶解能力最大,在磷酸三钙液体培养基中有效磷含量为427.1mg/L,拉恩式菌W25对碳源的利用顺序依次为葡萄糖>乳糖>蔗糖>甘露醇>淀粉,对氮源的利用顺序依次为硝酸铵>氯化铵>硫酸铵>硝酸钠>硝酸钾。3.培养液中碳源和氮源的浓度对拉恩式菌W25溶磷能力影响较大,合适的硝铵配比有助于菌株的生长和溶磷能力的发挥,硝态氮和铵态氮比例为25:75和50:50时,菌株的溶磷量比单独以硫酸铵为氮源高6.27%和6.31%;不同碳氮磷源条件下拉恩式菌W25溶磷能力不同,产酸的种类也不同,菌株溶磷能力的大小不仅与产生有机酸的种类有关,而且还与有机酸的含量有关。4.磷细菌蜡样芽孢杆菌、拉恩式菌、假单胞菌1、假单胞菌2彼此之间及组合均无拮抗关系,拉恩式菌+假单胞菌1+假单胞菌2在磷酸三钙培养液中有效磷含量为609.10mg/L,从不同组合磷细菌对磷酸三钙溶解能力方面考虑,确定最佳磷细菌组合为拉恩氏菌+假单胞菌1+假单胞菌2;拉恩式菌+假单胞菌1+假单胞菌2对碳源的利用顺序依次为葡萄糖>甘露醇>蔗糖>麦芽糖>淀粉,对氮源的利用顺序依次为硫酸铵>硝酸钾>硝酸钠>尿素>氯化铵;不同碳源、氮源、培养液初始pH及接菌量拉恩式菌+假单胞菌1+假单胞菌2生长量及溶磷能力不同,拉恩式菌+假单胞菌1+假单胞菌2最佳生长条件是葡萄糖15g/L,硫酸铵为0.13g/L,培养液初始pH为7,接菌量3%,各因素对拉恩式菌+假单胞菌1+假单胞菌2生长的影响大小依次为葡萄糖>硫酸铵>接菌量>pH;拉恩式菌+假单胞菌1+假单胞菌2发挥最佳溶磷能力培养基配方:葡萄糖15g/L,硫酸铵为0.067g/L,培养液初始pH为7,接菌量1%,各因素对拉恩式菌+假单胞菌1+假单胞菌2溶磷能力的影响大小依次为葡萄糖>pH>接菌量>硫酸铵,在最佳培养条件的溶磷能力为664.29mg/L,较普通溶磷菌发酵培养基溶磷量显著增加55.19mg/L5.磷细菌不同处理复垦土壤磷细菌数量在培养7d后达到最大值,磷细菌+葡+尿+有机肥处理土壤磷细菌数量最多,为6.5×108,分别是磷细菌、磷细菌+尿、磷细菌+葡、磷细菌+葡+尿处理的65倍、29.5倍、9.3倍、5.4倍,磷细菌各处理在培养60天后土壤中磷细菌数目仍保持在3.3×104(CFU/g鲜土),磷细菌与葡萄糖,尿素和有机肥共同施入复垦土壤中,对复垦土壤磷细菌数量的增加具有明显的促进作用;在复垦土壤上磷细菌、葡萄糖、尿素及有机肥混合施用,可以显著增加土壤有效磷含量,磷细菌+葡+尿+有机肥处理土壤有效磷含量分别比有机肥、磷细菌+葡处理多16.63mg/kg、183.17mg/kg;磷细菌+葡+尿+有机肥、磷细菌+葡+尿、磷细菌+葡处理复垦土壤碱性磷酸酶含量比单施磷细菌处理显著增加9.56、6.54、2.22倍,磷细菌+葡+尿+有机肥处理土壤酸性磷酸酶为10.33mg/kg,与磷细菌其它各处理相比差异显著。磷细菌处理与空白处理相比,土壤最大吸磷量降低64.1mg/kg,吸附常数降低0.008,最大缓冲容量降低10.58mL/g,解吸磷量增加,平均解吸率增加2.03%,磷细菌、葡萄糖、尿素、有机肥配合施用,比单施磷细菌处理对土壤吸附解吸影响更大,磷细菌+葡+尿+有机肥处理比单施磷细菌处理土54.95mg/kg,吸附常数降低0.019,最大缓冲容量降低1693mL/g,解吸磷量增加,平均解吸率增加20.52%。6.盆栽油菜试验中,在油菜整个生长周期内,不同施肥处理中磷细菌肥与磷酸钙配复垦土壤有效磷增加量最多,磷细菌肥+磷酸三钙施肥处理复垦土壤有效磷含量都高于其它处理,苗期磷细菌肥+磷酸三钙处理土壤有效磷含量比其它施肥处理增加0.29-1.61倍,中期比其他处理增加0.08-3.76倍,收获期比各处理增加0.40-4.45倍;油菜苗期和收获期,不同施肥处理中土壤Ca2-P、Ca8-P、Al-P、Fe-P含量以磷细菌肥+磷酸三钙为最高,苗期磷细菌肥+磷酸三钙处理土壤Ca2-P、Ca8-P、Al-P、Fe-P含量比其它处理分别多23.2-43.4mg/kg、62.3-127.3mg/kg、32.2-133.1mg/kg、4.8-40.lmg/kg,油菜收获期磷细菌肥+磷酸三钙处理土壤Ca2-P、Ca8-P、Al-P、Fe-P含量比其它处理分别多5.3-20.lmg/kg、63.95-97.83mg/kg、23.9-74.3mg/kg、3.1-34.9mg/kg,在油菜收获期,空白、有机肥、磷细菌肥、磷细菌肥+磷酸三钙、有机肥+磷酸三钙、磷细菌肥+磷矿粉、有机肥+磷矿粉复垦土壤Ca10-P含量与苗期相比分别下降了0.5%、1.5%、5.4%、5.3%、3.7%、2.8%、1.7%,收获期不同施肥处理复垦土壤O-P含量与苗期相比基本无变化;土壤Olsen-P与土壤Ca2-P呈极显著的正相关(p0.01),土壤Olsen-P与土壤Ca8-P、A1-P、Fe-P呈显著的相关性(p<0.05),与O-P、Ca10-P无相关性,土壤Olsen-P与土壤Ca10-P不具有相关性;不同施肥处理复垦土壤碱性磷酸酶活性比空白增加了4.54%-118.24%,土壤蔗糖酶活性分别比空白处理增加了12.66%-113.12%,土壤脲酶活性分别比空白增加了77.01%-231.61%,单施磷细菌肥处理土壤三种酶活性高于其它处理;不同施肥处理油菜产量比空白处理增加了16.2%-77.6%,磷细菌肥+磷酸三钙处理油菜产量为101.6g/盆,比其它施肥处理增加7.8%-52.8%。7.大田玉米试验不同施肥处理中,磷细菌肥处理复垦土壤微生物氮含量最大,分别比空白、常规施肥、基质处理增加6.6倍、3.4倍、1.2倍;各处理中磷细菌肥处理土壤有效磷、速效钾、磷酸酶、蔗糖酶、脲酶含量都最高,磷细菌肥处理土壤有效磷比其它处理增加0.38-4.51倍,土壤速效钾增加17.6%-64.2%,土壤磷酸酶含量增加20.3%-35.5%,土壤脲酶含量增加40.1%-169.7%,土壤蔗糖酶含量增加21.1%-90.5%,施用磷细菌肥可以明显改善复垦土壤养分及生物活性;不同处理玉米产量大小依次为磷细菌肥>基质>常规施肥>空白,磷细菌肥处理玉米增产显著,玉米产量为535kg/亩,分别比基质、常规施肥增加8.1%、11.1%,在复垦土壤上施用磷细菌肥可以显著增加玉米产量。
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