Fn在硅烷化无机材料表面固定及定量表征方法研究

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将蛋白质等生物大分子固定在无机生物材料表面,能够在不影响这些材料优良的本体性能的基础上,大幅度提高其生物相容性。然而,目前还没有专门的方法对固定于无机材料表面的蛋白质进行定量检测。本文分别研究了纤连蛋白(Fn)分子在氧化钛表面的固定、Fn分子与CD34抗体在纯钛表面的固定、牛血清白蛋白(BSA)、Fn和层黏连蛋白(Ln)分子在Ca-Na玻璃表面的固定以及Fn分子在石英玻璃表面的固定。并应用水接触角、傅立叶变换红外光谱、X光电子能谱和原子力显微镜等对这些蛋白分子的固定过程进行了检测和分析。使用MicroBCA蛋白定量方法,对这些蛋白的固定进行了量化研究,并且分析了该蛋白定量方法在不同材料表面上的应用,以期探索出一种能够广泛适用于材料表面固定化蛋白定量检测的有效手段,以指导无机生物材料表面生物化修饰的研究。(1)通过磷酸化学吸附,氧化钛薄膜表面获得了大量羟基。在此基础上,进行钛氧薄膜表面硅烷化以引入了氨基,最后,在EDC/NHS体系催化下,将Fn分子共价固定于氧化钛表面。傅立叶变换红外光谱结果和水接触角分析显示蛋白分子固定成功。(2)氧化钛薄膜导致MicroBCA蛋白定量检测呈假阳性。排除光催化导致氧化钛产生自由基的干扰后,假阳性数值仅降低15.3%。MicroBCA试剂假阳性产生的机制有待进一步探索。(3)在纯钛表面,以层层自组装方法固定在外层的蛋白,能够通过MicroBCA方法进行定量检测;但是仅在固定量较大情况下适用于以APTE偶联方法获得的固定化蛋白分子定量。(4)在Ca-Na玻璃表面,通过APTE偶联分别共价接枝BSA、Fn和Ln,其接枝面密度分别为0.22μg/cm2, 0.907μg/cm2和0.38μg/cm2。(5)在一定范围内,随孵化液浓度增加,硅烷化表面固定的Fn量也增大。孵化液的浓度在25~75μg/mL之间变化时,这个效应最为显著。当孵化液浓度高于75μg/mL时,硅烷化表面蛋白固定量接近3μg/cm2,且不再随孵化液浓度增加而显著增多。综上,本文为无机生物材料表面改性与修饰研究中生物大分子的量化表征提供了一种新方法。
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