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猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)可引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine Circovirus Associated Diseases,PCVAD),在世界范围内普遍流行。目前,疫苗接种是防控PCV2最有效的手段,其中基于PCV2 Cap蛋白(Capsid protein)组装的病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)亚单位疫苗因具有高效和安全的特点,已经被广泛应用于猪场PCV2的预防。然而,疫苗接种并不能完全净化猪场中PCV2,因此开发更高效、快速的PCV2疫苗渐成研究热点。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)能特异性识别细胞表面的整合素,可参与诱导病毒内化,研究表明RGD修饰可以促进人乙肝病毒等病毒VLPs或兔出血热病毒、芜菁黄花叶病毒属等病毒对细胞的粘附,甚至增强其免疫原性。而RGD在PCV2上的研究尚未被报道。本研究目的在于探究RGD修饰对PCV2 VLPs入侵细胞特性及免疫原性的影响。首先我们在缺失了核定位信号(Deleted nuclear localization signal,DNLS)的PCV2 Cap蛋白Loop CD的N端进行了RGD多肽的替换和插入修饰。突变体蛋白在大肠杆菌(BL21)表达系统中表达并在体外进行组装。随后,用电子显微镜对组装的VLPs进行鉴定,并利用间接免疫荧光试验探究RGD嵌合型VLPs入侵细胞特性。其次,我们将成功组装的VLPs免疫清洁级昆明小鼠,通过ELISA法检测其体液免疫和细胞免疫应答反应。最后我们通过免疫共沉淀和质谱方法进一步探究展示在PCV2 VLPs表面的RGD与细胞表面蛋白受体的互作关系。研究结果显示,在PCV2-DNLS Cap蛋白Loop CD的N端插入了一个拷贝RGD多肽序列(iRGD)和替换了Loop CD区8个氨基酸的以GS连接包含两个拷贝RGD多肽序列(rRGD)均能成功表达和纯化。iRGD突变型蛋白在体外成功组装成VLPs,且能入侵IPEC-J2、PK15等细胞,而rRGD突变型蛋白未能成功组装成VLPs。小鼠体内免疫结果显示,与WT-VLPs比,iRGD-VLPs免疫的小鼠其PCV2特异性IgM和IgG抗体水平均显著升高,同时,细胞因子检测结果显示,iRGD-VLPs能刺激小鼠脾淋巴细胞产生更高水平的IFN-γ。同时,我们观察到RGD插入修饰PCV2 VLPs在细胞分布中不同于野生型VLPs,质谱结果显示,RGD修饰后的PCV2 VLPs与宿主细胞上硫酸乙酰肝素受体蛋白、肌动蛋白相关蛋白及核仁素等受体蛋白结合力更强,同时能特异性地靶向一些细胞宿主蛋白,如黏着斑蛋白Vinculin、CD44及其他与病毒入侵细胞相关的蛋白。这些结果有助于解释由RGD插入引起的增强PCV2 VLPs免疫原性的影响。本研究所形成的结果为提高PCV2 VLPs免疫原性研究提供了一定参考,同时为解析RGD修饰对PCV2入侵细胞的作用机制及以PCV2 VLPs为载体的疫苗的研发和应用奠定基础。