第一部分Lewis大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养、表型鉴定及生物学特性的研究目的:将Lewis大鼠骨髓间充质干细胞进行了原代分离,通过体外培养扩增,观察细胞的生物学特性,并进行了鉴定。行混合淋巴细胞培养,及测定IL-2、IL-4、IL-10和干扰素γ水平,为本实验的下一步研究提供了基本条件及实验依据。方法:贴壁培养法分离纯化Lewis大鼠BMSC体外培养和连续传代,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化,摄片及绘制生长曲线;取第三代BMSC行CD34、CD44免疫组化法鉴定,用流式细胞仪行特征性抗体CD34、CD44、CD45、CD90的表型分析;混合淋巴细胞培养体系(MLC),取正常DA和Lewis大鼠脾脏,尼龙毛吸附法制备纯化T细胞,分别作为刺激细胞和反应细胞,于反应细胞培养板中加入丝裂霉素C处理过的2.5×10~5个BMSC作为实验组,只加培养液的孔作为空白孔,单纯刺激细胞加反应细胞为空白对照,单纯加BMSC为调控细胞对照,计算细胞生长抑制率;在BMSC原代培养至第3、5d,收集半量换液之离心上清,酶联免疫法(ELISA)测定IL-2、IL-4、IL-10和干扰素γ水平。结果:BMSC体外培养生长状况良好,单个细胞呈狭长梭形,排列有明显方向性呈旋涡状、网状,复层生长的细胞形态呈多边角型;生长曲线近似“S”形;经免疫组化法鉴定,血管源性细胞表面抗原CD34表达阴性,而BMSC相对特异性标记物CD44表达阳性;流式细胞仪检测,CD34、CD44、CD45、CD90细胞阳性率分别为7.9%±1.3%、89.5%±4.5%、4.3%±0.5%、95%±3.8%;在MLC体系中,实验组吸光度A值为0.769±0.154,对照组A值为1.479±0.126,抑制率为48.05%,表明当BMSC与T细胞比值为1:1时,T淋巴细胞增殖明显受到抑制;在BMSC原代培养至第3d、5d、7d、9d,收集半量换液之离心上清,酶联免疫法(ELISA)测定IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ水平发现其含量与空白对照组无明显差别。结论:贴壁筛选法成功获得BMSC,从形态学、免疫组化、细胞表型、功能活性等方面对其进行全面鉴定,证实了分离、培养体系的正确性。实验并证实了BMSC对T淋巴细胞的增殖有明显的抑制作用,且从BMSC培养上清液中检测IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平发现其含量与空白对照组无明显区别。满足进一步实验的要求。第二部分建立DA-Lewis大鼠原位肝移植急性排斥模型目的:建立大鼠原位肝移植急性排斥模型,为进一步的实验研究奠定基础。方法:DA大鼠做为供体,雄性Lewis大鼠做为受体,采用改良后的Kamada“二袖套管法”,建立大鼠原位肝移植模型。观察术后存活情况,并对其生存时间及术后的生存率进行统计分析。结果:20例大鼠肝移植手术中,术后超过48小时的有17例,供体手术时间(30±8)min,修肝时间(15±2)min,受体手术时间(60±7)min,无肝期时间(21±3)min,手术成功率85%。术后4至5天开始出现黄疸,精神差,睁眼困难,反应迟钝,并于术后13天内全部死亡。结论:根据近交系大鼠自身结构特点,对大鼠原位肝移植模型建立方法进行了改进,取得了一定的成效。DA-Lewis为稳定、可靠的大鼠肝移植急性排斥模型,是研究肝移植排斥反应及免疫耐受的理想动物模型。第三部分回输同基因BMSC对肝移植大鼠的免疫调节作用研究目的:通过大鼠肝移植术中经门静脉回输同基因骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞的低免疫原性和免疫调节特性,并研究其对异基因大鼠移植肝的保护作用。方法:用贴壁筛选法,体外分离培养Lewis大鼠的骨髓间充质干细胞,并取第三代用流式细胞仪行表型分析及鉴定,见第一部分。用DA大鼠做为供体,雄性Lewis大鼠做为受体,采用改良后的Kamada“二袖套管法”,建立大鼠原位肝移植急性排斥模型,见第二部分。实验分4组,A组行DA-Lewis大鼠原位肝移植,做为空白对照组(n=24),术中经门静脉输注生理盐水1ml:B组为环胞素组(n=24),手术同A组,术后2d经胃予环胞素A10mg/kg,每天一次;C组BMSC组(n=24),行DA-Lewis大鼠原位肝移植,术中经门静脉输注术前准备好的骨髓间充质干细胞2×10~6cells,共1ml;D组BMSC+环胞素A组(n=24),手术同C组,术后2d经胃予B组半量的环胞素,5mg/kg,每天一次。观察受体术后生存时间和一般情况,各组分成4个亚组(n=6),留1个亚组观察大鼠移植后生存期,另外3个亚组分别于移植后3d、7d和10d处死大鼠,检测血清ALT,AST,TBIL水平;ELISA法测定IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ水平;用流式细胞仪检测肝细胞和肝组织内Th1细胞凋亡;肝组织行HE染色,进行病理组织学检查,并进行评分(根据Banff分级评分方案)。结果:和A组比较,B、C、D组生存期明显延长(P＜0.05);移植术后各组大鼠血清生化检查:在移植术后4、7、10d肝功能B、C、D组逐渐恢复,A组ALT、AST、TBIL急剧上升,与存活时间表现一致。A组IL-2、IFN-γ明显高于B、C和D组(P＜0.01);IL-4、IL-10值A组明显低于B、C和D组(P＜0.01)。B、C和D组的肝细胞凋亡率明显低于A组(P＜0.05),差异有显著性,B、C、D组肝组织Th1细胞凋亡比率低于A组,(P＜0.05)。肝脏病理示术后7d、10d,A组的Banff评分明显高于B、C、D组(P＜0.05),B、C、D3组无明显差异(P＞0.05)。结论:(1) BMSC可以改善大鼠移植肝的功能、降低移植肝排斥反应病理学评分,延长其生存期。(2) BMSC可以改变T细胞亚群细胞因子的分泌量,抑制淋巴细胞的增殖。并可诱导大鼠肝组织内Th1细胞凋亡,降低移植肝细胞的凋亡率,减轻肝移植后的排斥反应。(3)环胞素A对BMSC抑制肝移植后急性排斥反应起协同作用,移植术后早期可以减少免疫抑制剂的使用,从而减轻免疫抑制剂的副作用。