栽培花生(Arachis hypogaea L.),又名“落花生”或“长生果”,花生在榨油、食品加工、化工等领域都起着重要作用。我国的花生产量占油料作物总产的1/2,占世界花生总产的1/3,居世界首位。在国内农作物中,花生的种植规模已经上升到第七位,而农业产值居第五位。花生与大豆、油菜等其它油料作物相比,花生具有产量高、含油量的特点,是人们食用油和优质蛋白的主要来源,因此,花生产业的发展对我国国民经济的发展和粮油安全具有重要意义。此外,花生具有抗旱耐瘠薄、适应性强的特点,花生中有许多独特和优异的基因资源值得挖掘。因此,近年来花生功能基因组学成了花生研究领域的热点。花生栽培种为异源四倍体(2n=4X=40,AABB),基因组大小约为2800 Mb,相当于拟南芥基因组的20倍,大豆的2.5倍,水稻的5倍,接近人类基因组大小,是大约3500年前由单一杂交事件发展演化而成,其遗传背景非常狭窄。与水稻、玉米等粮食作物相比,花生功能基因组学研究相对落后。庞大的基因组使得常规方法进行基因组测序费用太高,序列拼接难度大。因此,构建cDNA文库进行ESTs测序,是花生基因克隆和功能研究的经济有效的手段。本研究以花生主栽品种鲁花14号的未成熟种子(包括各个发育阶段的混合种子)为材料,构建了花生种子cDNA文库,EST测序17000条,并对所有EST做了功能注释和分类,向GenBank中提交序列8569条。对这些序列的生物学功能的注释结果表明,种子储藏蛋白基因以及蛋白降解代谢相关基因占28.8%,是序列中所占比例最大的一类基因,其中包括花生所有的过敏原基因；代谢相关的基因占12.5%；胁迫及抗病相关的基因占5.6%；转录因子基因相关序列占4.6%,为研究花生种子的转录调控提供了良好的切入点；而编码未知蛋白和GenBank中未发现同源序列的基因分别占20.1%和13.9%。将这些ESTs通过生物信息学分析聚类后得到734个Contigs和2759条Singlets。基因芯片也是功能基因组学研究的重要手段之一。在研究基因表达谱,基因的调控,基因互作和基因的功能等方面都具有重要作用。本研究从花生种子EST中挑选5066条序列(代表3493个Uni-EST)制备cDNA基因芯片。通过芯片杂交,系统分析了这些基因在花生不同组织器官(根、茎、叶、花、种子)中的表达情况,获得了一些具有组织器官特异性表达或高水平表达的基因。其中277条ESTs在种子中表达量比在其它组织(根、茎、叶、花和果针)中高,其中大部分是在种子中特异表达的基因,这些基因主要是编码种子储藏蛋白的基因,如花生过敏原基因、LEA蛋白基因等,还有一些脂肪酸代谢相关的基因,如油体蛋白基因、脂肪氧合酶基因等。在种子中表达上调的基因中,超过1/3的基因在种子中的表达水平是在其它组织中表达水平的10倍以上,其中40%是种子储藏蛋白和脂类代谢相关的基因,代谢途径的关键酶基因占10%。此外,在种子中表达上调的基因还包括转录因子LEC1和B3结构域基因。有些基因在种子中的表达水平下调,例如过敏原8,在根中的表达量是种子中的28倍。利用基因芯片对花生种子不同发育时期(DAP15、DAP25、DAP35、DAP45,以DAP70为对照)的基因表达情况进行研究,获得了大量在种子发育的特定时期特异表达或高水平表达的基因(表达上调2倍或2倍以上)。其中有550条ESTs在DAP15(果针入土后15天)表达上调。这些ESTs涉及代谢、信号转导、转录、转运、生物和非生物胁迫相关的基因；在DAP 25表达上调的EST有175条,包括一些酶类,例如乙酰辅酶A羧化酶、干扰素溶菌体酶,转录因子类等；在DAP35表达上调的EST有65条,这些EST主要是种子储藏蛋白；在DAP45时期,有17个基因的表达水平比DAP15、DAP25和DAP35高,其中有4个热休克蛋白基因,其它还包括抗逆和抗病基因、转录因子基因等。基因芯片分析所获得的结果,有助于丰富目前十分缺乏的花生基因表达调控信息,对于促进花生分子生物学研究具有重大意义。胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein, LEA)是植物胚胎发育后期在种子中大量积累的一类蛋白,不仅在种子正常发育过程中起重要作用,而且参与植物营养体对水分胁迫的抗性。本研究通过EST注释,从花生cDNA文库中鉴定出271条LEA相关序列,系统克隆了19个花生LEA基因,分属8个不同的组,对这些基因编码的蛋白与其他植物同源蛋白进行比较发现该类蛋白在进化上具有一定的保守性。利用半定量RT-PCR的方法对花生LEA家族基因的表达情况进行研究,结果显示大多数LEA基因在种子中的表达量都相对较高,而部分LEA基因在根、茎、叶、花、果针等组织器官中也有较高的表达。研究结果揭示了花生LEA家族基因的表达特点,为进一步阐明花生种子成熟过程中物质积累过程和脱水干燥机制奠定了基础。本研究对属于第二组LEA蛋白基因的花生脱水素基因AhDHNl进行了较详细的研究,构建了该基因的植物表达载体并转化烟草和拟南芥,进行了原核表达以及Northern检测等工作,为进一步研究脱水素在花生正常种子发育以及抗逆过程中的作用奠定了基础。本研究主要创新点：1通过构建花生种子的全长cDNA文库,并进行大规模EST测序,获得了大量的抗逆、脂肪酸代谢、蛋白储藏、种子发育相关的基因,丰富了数据库中花生基因序列信息,为花生控制重要农艺性状基因的克隆和功能研究奠定了基础。2首次制备花生种子cDNA基因芯片,利用芯片对不同组织之间以及种子不同发育时期的基因表达情况进行研究,从中获得大量花生基因表达的重要信息,为组织特异性、发育时期特异性基因的鉴定和克隆,以及这些基因启动子的分析和利用奠定了基础,为花生基因表达的高通量分析建立了一个重要平台。3首次系统克隆和分析了花生LEA蛋白基因家族,对其序列特征、在花生不同组织以及花生种子发育的不同时期的表达模式进行了详细研究;研究了花生LEA蛋白基因在高盐、ABA、低温以及PEG等处理条件下的表达情况。为深入探讨LEA基因在花生生长发育以及逆境适应中的作用奠定了基础。4克隆花生脱水素AhDHNl基因,研究了该基因在种子不同发育阶段的表达情况,构建了植物表达载体,并分别转化了拟南芥和烟草,为进一步的功能研究奠定了基础。