酸奶因其营养价值高、风味独特以及良好的保健效果,深受广大消费者的青睐。传统的酸奶是以牛乳为原料,经嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)的协同作用发酵而成。乳糖是牛乳中主要的碳源,是一种由葡萄糖和半乳糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的双糖,也是乳品发酵过程中乳酸菌生长繁殖的重要能量来源。但是绝大多数的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌只能利用乳糖水解后的葡萄糖部分,而将半乳糖部分释放到胞外。乳制品中未利用完的乳糖和积累的半乳糖不仅会影响产品的质量,也会对人体健康造成负担,尤其是乳糖不耐症和半乳糖血症患者。本论文针对嗜热链球菌代谢乳糖和半乳糖的特点,从其基因组上分别鉴定出乳糖和半乳糖操纵子结构。发现嗜热链球菌虽然具有编码半乳糖代谢途径相关酶的基因,但由于启动子活性不足导致其不能利用半乳糖。因此,本论文首先对嗜热链球菌半乳糖操纵子的启动子进行了优化,建立了随机突变启动子库。选择强突变型启动子分别驱动嗜热链球菌半乳糖激酶基因galK和半乳糖操纵子galKTE的表达,提高了菌株利用半乳糖能力。为了进一步降低酸奶中半乳糖含量,本论文还选择了具有较强利用乳糖和半乳糖能力的植物乳杆菌与酸奶发酵剂菌株共培养,有效地降低了酸奶中总糖含量。最后对该株植物乳杆菌进行代谢工程改造,使其作为底盘生物高效表达β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶,成功地实现了将乳糖转化为高附加值的D-塔格糖,该研究为高品质酸奶开发奠定了基础。具体成果如下:1.嗜热链球菌的乳糖/半乳糖操纵子结构及活性分析探究野生型嗜热链球菌无法利用半乳糖的原因,能够为改造获得稳定的半乳糖发酵菌株提供新的策略。过去的研究认为,嗜热链球菌不利用半乳糖是由于菌体细胞内缺少分解代谢半乳糖的酶类。然而,随着嗜热链球菌生理遗传研究的深入以及全基因组测序技术的发展,在已公布的嗜热链球菌全基因组上均可以预测到编码半乳糖代谢途径(Leloir Pathway)所需酶的完整操纵子基因galKTEM。本论文对44株嗜热链球菌利用乳糖/半乳糖能力进行了研究,发现16%(7株)嗜热链球菌表现为Gal+表型(半乳糖利用,galactose positive,Gal+),84%(37株)嗜热链球菌表现为Gal-表型(半乳糖不利用,galactose negative,Gal-)。在乳糖环境中生长时,不管是Gal+还是Gal-表型的嗜热链球菌在消耗乳糖的同时均会向胞外分泌半乳糖,造成半乳糖的积累。当乳糖含量低于1 g/L时,Gal+表型和部分Gal-表型的嗜热链球菌开始代谢前期积累的半乳糖,但直至24 h半乳糖仍然不能被完全代谢。设计引物扩增galR-galK基因区间并测序分析,比对结果表明该区间序列虽不是决定嗜热链球菌半乳糖表型的唯一因素,但对于菌株的半乳糖代谢能力发挥着重要的作用。2.构建利用半乳糖的嗜热链球菌菌株为了降低酸奶等发酵乳制品中半乳糖的含量,构建能够高效利用半乳糖的嗜热链球菌菌株具有重要意义。鉴于嗜热链球菌的gal启动子活性决定着Leloir途径相关基因的表达水平,进而影响菌株代谢半乳糖的能力。本部分我们对嗜热链球菌的gal启动子进行了优化,利用简并引物建立了随机突变启动子库。以绿色荧光蛋白作为报告蛋白筛选出强突变型启动子P59,该启动子活性比原始启动子提高6.7倍。随后用该启动子在质粒上分别表达半乳糖激酶基因galK和半乳糖操纵子galKTE,发现重组菌株利用半乳糖的能力得到提高,并且能在代谢乳糖的同时代谢部分半乳糖,有效地降低了培养基中半乳糖的积累。将获得的Gal+嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌共培养发酵酸奶,酸奶中半乳糖的含量降低。进一步通过同源重组技术,将突变得到的强启动子替换嗜热链球菌基因组上gal操纵子的原始启动子,获得的突变株不能利用半乳糖,并且在乳糖培养基中生长能力降低。利用RT-PCR检测突变株galR-galKTEM操纵子转录水平,与野生株相比,突变株galR转录水平提高,同时galKTEM转录水平下降。推测转录调控因子GalR对galKTEM操纵子的转录具有抑制作用,从而导致菌株不利用半乳糖。这一结果也启示在基因组上编辑启动子的同时需要考虑对其他临近基因的影响。3.植物乳杆菌与传统酸奶发酵剂共培养生产低糖酸奶嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌这一传统发酵剂组合在牛奶中生长时对乳糖的利用存在上限,为了进一步降低酸奶中乳糖/半乳糖含量,本部分探究了植物乳杆菌与传统酸奶发酵剂共培养对酸奶中糖含量的影响。研究发现植物乳杆菌WCFS1能有效代谢乳糖和半乳糖。比对全基因组序列,植物乳杆菌WCFS1的基因组上存在两个β-半乳糖苷酶编码基因lacA和lacLM,以及完整的半乳糖代谢途径(Leloir pathway)编码基因。以绿色荧光蛋白作为报告蛋白检测启动子强度,发现植物乳杆菌WCFS1半乳糖操纵子的启动子在葡萄糖、乳糖和半乳糖培养基中均组成型地强表达,这一特性赋予了它与传统发酵剂共培养生产低糖酸奶的潜能。植物乳杆菌WCFS1与嗜热链球菌或保加利亚乳杆菌在以乳糖为唯一碳源的培养基中共同培养时,乳糖能够被完全消耗,并且半乳糖也被有效代谢。发酵乳实验中,使用传统发酵剂总糖降低率最高可达18.40%,添加植物乳杆菌共培养后总糖降低率提高至26.00%。此外,采用植物乳杆菌与传统发酵剂共培养生产的酸奶活菌数约提高1.6倍,感官评价显示发酵所得酸奶在外观、质地和风味上均能被消费者所接受。因此,利用植物乳杆菌与传统发酵剂共培养生产酸奶是有效降低产品中总糖含量的一种手段。4.植物乳杆菌乳糖/半乳糖诱导型表达系统及其应用乳糖/半乳糖诱导型表达系统因其诱导物的安全性,在细菌中得到广泛的应用。但是这一类启动子在乳酸菌中的驱动强度有限,限制了其在乳酸菌中的应用与发展。本研究发现,植物乳杆菌WCFS1在乳糖或半乳糖培养基中生长时具有β-半乳糖苷酶活性,而在葡萄糖培养基中未检测到该酶活。在前期研究中我们发现植物乳杆菌WCFS1的基因组中存在两个β-半乳糖苷酶编码基因,分别为lacA和lacLM。分别克隆这两个基因的启动子,以绿色荧光蛋白为报告蛋白,发现lacA基因的启动子PlacA为乳糖诱导型启动子,而lacLM基因的启动子PlacLM为乳糖/半乳糖诱导型启动子。通过优化这两个启动子的-35区,-10区以及核糖体结合位点的序列,启动子的强度有了不同程度的提高。与原始启动子相比,启动子PlacA的乳糖诱导强度提高10.4倍,启动子PlacLM的乳糖诱导强度和半乳糖诱导强度分别提高12.7倍和9.0倍。用优化后的启动子在植物乳杆菌WCFS1中异源表达嗜热链球菌来源的β-半乳糖苷酶,其中含启动子PlacLM-35-10的重组菌株中β-半乳糖苷酶活性最高,为45.72±0.44 U/mL。利用Western Blot检测重组蛋白表达量,发现优化后的启动子不仅能在乳糖/半乳糖培养基中高效表达异源蛋白,也能够在发酵乳中高效发挥作用。因此,本部分构建了乳糖/半乳糖诱导的高效表达系统,从而扩展了植物乳杆菌表达重组蛋白的工具箱。5.利用植物乳杆菌工程菌株生产D-塔格糖D-塔格糖是一种稀有的天然六碳酮糖,作为可替代蔗糖的功能性甜味剂备受关注。本研究中,我们构建了一株植物乳杆菌工程菌株,使其能够转化乳糖生产D-塔格糖。利用原噬菌体重组酶介导的同源重组系统改造植物乳杆菌WCFS1中乳糖/半乳糖代谢通路,将其半乳糖激酶基因galK缺失突变,同时β-半乳糖苷酶基因lacLM的原始启动子替换为乳糖/半乳糖诱导型强启动子PlacLM-35-10。进一步异源表达干酪乳杆菌SDMC050286的L-阿拉伯糖异构酶AraA,最终得到一株D-塔格糖生产菌株WCFS1/△galK-PlacLM-35-10-araA。该菌株β-半乳糖苷酶活性提高5.4倍,半乳糖代谢途径被阻断,同时能够有效地表达L-阿拉伯糖异构酶。对静息细胞转化乳糖生产D-塔格糖的条件进行优化,最适温度和最适pH分别为65℃和pH 7.5。静息细胞在125 g/L乳糖中反应4 h可完全水解乳糖,56 h后转化乳糖生产D-塔格糖的转化率可达33%。本研究在实验室水平验证植物乳杆菌工程菌株以乳糖为原料生产D-塔格糖的可行性,从而为以乳酸菌作为细胞工厂转化乳糖生产D-塔格糖的工业化应用奠定了基础。