论文部分内容阅读
目的:研究Kruppel样转录因子家族成员KLF12调控胚胎黏附及间质细胞蜕膜化的分子机制。方法:通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Westerm Blot联合免疫组化方法分析KLF12、白血病抑制因子(LIF)及孤儿核受体NR4A家族成员Nur77在正常可孕妇女增殖期及分泌期内膜表达差异,并同时检测体外雌孕激素联合刺激后KLF12、LIF及Nur77表达变化。进一步检测KLF12、LIF及Nur77于反复种植失败(RIF)患者子宫内膜表达情况。分别通过qRT-PCR及Western Blot方法检测腺病毒介导的上皮细胞(Ishikawa细胞)及人子宫内膜间质细胞(hESC)KLF12高表达分别对LIF及Nur77的表达影响;荧光素酶报告基因、染色质免疫共沉淀PCR(ChIP/PCR)及链亲合素-生物素偶联DNA沉淀反应(ABCD)共同证实KLF12直接结合于LIF及Nur77启动子区保守序列并影响其转录活性。在此基础上进一步通过体外胚胎-上皮细胞黏附模型明确KLF12通过调控LIF表达影响胚胎黏附;通过酶联免疫荧光测定法(ELFA)、细胞免疫荧光及体外胚胎-间质细胞种植模型明确KLF12通过调控Nur77表达影响hESCs蜕膜化进程。最终通过Loxp-Cre系统构建Klf12子宫特异性敲入小鼠在体验证KLF12对LIF及Nur77表达的调控作用。结果:月经周期中增殖期内膜KLF12表达较高,而LIF及Nur77表达则于分泌期显著增高,且雌孕激素联合刺激Ishikawa细胞及hESCs后KLF12表达于48 h明显降低而LIF及Nur77表达均于早期显著升高;RIF患者(n=22)子宫内膜KLF12表达较正常可孕妇女(n=18)内膜显著增高,同时LIF及Nur77表达明显减少,且均与KLF12表达呈中度负相关。Ishikawa细胞中KLF12高表达可以抑制LIF表达,并且显著抑制BeWo细胞球黏附率及小鼠囊胚黏附稳定性;hESCs高表达KLF12可以抑制Nur77表达使得hESCs蜕膜化泌乳素(dPRL)分泌减少、细胞骨架蜕膜样变受限及BeWo细胞球扩张/小鼠囊胚孵化受抑。进一步探索机制发现,KLF12可以分别通过结合LIF及Nur77启动子区保守序列(CAGTGGG)抑制此二者转录活性。在体动物实验成功构建Klf12子宫特异性敲入小鼠Klf12loxP/loxPPgrcre/+(Klf12d/d)并验证其子宫组织KLF12高表达,进一步Westem Blot检测证实KLF12子宫特异性高表达后相应Nur77、LIF及其下游分子表达显著降低。结论:月经周期中子宫内膜KLF12表达于分泌期显著降低而LIF及Nur77明显增高,并且雌孕激素联合诱导后KLF12表达下降,提示KLF12为胚胎种植负调控因子;RIF患者内膜上皮组分中异常高表达的KLF12通过转录抑制LIF的表达抑制胚胎黏附;而间质组分中异常增高的KLF12通过转录抑制Nur77表达显著抑制间质细胞蜕膜化,影响胚胎侵入过程,最终导致胚胎种植失败。同时Klf12子宫特异性敲入小鼠存在与体外实验一致的LIF及Nur77表达变化。KLF12调控胚胎种植机制的研究,能够为提高体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期中胚胎种植成功率提供坚实的理论基础。