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急性肺损伤是呼吸系统常见危重症之一。急性肺损伤的病理生理变化主要是肺泡上皮及血管内皮细胞屏障功能的下降,导致肺水肿,保持肺泡毛细血管膜的屏障功能的完整性以及促进肺泡毛细血管膜损伤后的修复,对于减轻和防治急性肺损伤具有重要意义。但气道上皮屏障功能下降以及损伤修复障碍在急性肺损伤中的作用目前研究甚少。细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)具有调控细胞周期、促进细胞增殖、迁移及维持细胞间连接等生物学活性,缺失cdc42所导致的气道上皮细胞屏障下降和损伤修复延迟对急性肺损伤的影响,目前还不明确。本课题旨在探索Cdc42缺失介导的气道上皮屏障下降和修复延迟在急性肺损伤中的作用及机制,为进一步明确气道上皮细胞屏障功能和损伤修复在急性肺损伤的作用,并寻找急性肺损伤治疗的相应靶点奠定研究基础。研究方法:第一部分:研究敲除cdc42对气道上皮细胞屏障功能和损伤修复的影响1.体内实验:1.1通过利用Cre/loxp技术构建气道上皮细胞特异性敲除Cdc42基因小鼠模型。1.2收取对照组及cdc42敲除组小鼠的肺组织,通过免疫组化染色评估气道上皮细胞增殖情况及细胞间连接蛋白的表达及分布情况。2.体外实验:2.1通过在16HBE(人支气管上皮样细胞系)转染siCdc42质粒稳定构建敲低Cdc42水平的气道上皮细胞。2.2通过免疫荧光、WB检测蛋白水平等评估对照组和敲除组的增殖能力及细胞间连接蛋白的表达情况。第二部分:研究缺失cdc42介导的气道上皮细胞屏障功能下降和修复延迟对急性肺损伤的影响。1.体内实验:采用气管内直接滴入脂多糖(LPS)构建急性肺损伤的小鼠模型,在给药后第1、3、7天不同时间观测点处死小鼠收取肺组织,对小鼠肺组织切片进行HE染色,同时计算病理评分评估急性肺损伤严重程度。2.体外实验:构建敲低Cdc42基因的细胞模型后给予LPS刺激,评估敲低cdc42对气道上皮细胞损伤后细胞修复和损伤后细胞间连接蛋白形成的影响。结果:第一部分:敲除Cdc42对气道上皮细胞屏障功能及损伤后修复的影响1.构建动物模型后,敲除组小鼠的气道上皮细胞中Cdc42蛋白表达明显小于未敲除组。2.敲除Cdc42的小鼠气道上皮屏障功能下降。3.敲除Cdc42的小鼠气道上皮增殖能力下降。4.敲低Cdc42的气道上皮细胞的增殖、迁移能力下降,细胞间连接蛋白表达下调。第二部分:Cdc42缺失介导的气道上皮细胞屏障功能破坏和修复延迟对肺损伤的影响。1.Cdc42敲除组小鼠在给药后第1、3、7天的急性肺损伤评分、气道周围中性粒细胞浸润程度均明显大于对照组,气道修复明显延迟。2.敲低Cdc42的气道上皮细胞损伤后细胞迁移、增殖能力下降,细胞间连接蛋白表达下调。3.Cdc42敲除组小鼠急性肺损伤后的气道内PAK-1的表达下降。结论:1.首次成功构建气道上皮细胞特异性敲除Cdc42基因的小鼠模型。2.敲除Cdc42基因降低了气道上皮细胞的迁移、增殖能力,减少细胞间连接形成,因此Cdc42是气道上皮屏障功能维持和修复的重要调控因子。3.Cdc42缺失介导的气道屏障功能下降和细胞损伤后修复延迟,明显加重了急性肺损伤,证明气道上皮细胞的屏障功能和修复能力在急性肺损伤的发生发展和后期修复中有重要作用,气道上皮细胞也是急性肺损伤的重要治疗靶点,促进气道上皮细胞屏障功能恢复和损伤修复可能会减轻急性肺损伤。4.Cdc42是调控气道上皮细胞屏障功能恢复和损伤修复的最重要的分子之一,干预增强Cdc42的活性,或者增强Cdc42下游分子靶点的活性,有可能通过加强气道上皮细胞屏障功能恢复和损伤修复,来减轻急性肺损伤。4.PAK-1的表达变化和Cdc42表达变化方向相一致,Cdc42可能是通过PAK-1信号通路发挥调控气道上皮屏障功能的维持和修复,PAK-1可能成为急性肺损伤的候选治疗靶点。