华容大叶芥菜主要化学成分及其乙醇提取物抗结肠炎机理研究

来源 :湖南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:marcomak99
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近年来,芥菜的植物化学成分及其功能作用研究引起了全球科学界的高度关注,特别是芥菜中硫代葡萄糖苷(Glucosinolates,GLS)的抗癌、抗炎、抗氧化等生物活性。华容大叶芥菜是我省的优选品种,年种植面积超50万亩,但其化学成分及其功能作用研究尚无报道,制约了其高值化利用。本论文以华容大叶芥菜为原料,采用HPLC-Q-TOF-MS等技术对新鲜和发酵芥菜及其乙醇提取物中的化学成分进行了研究,并以新鲜芥菜和发酵芥菜乙醇提取物为原料,探讨了其预防结肠癌和结肠炎的效果、机理和构效关系。主要结果如下:(1)华容大叶芥菜及其乙醇提取物主要化学成分研究以新鲜和不同发酵时间的华容大叶芥菜为原料,测定了新鲜和发酵芥菜及其乙醇提取物种的主要营养成分和GSL等的含量。结果表明:华容大叶芥菜中含有蛋白质、糖类、膳食纤维、维生素、矿物质、硫代葡萄糖苷等成分。新鲜芥菜不同部位的总GSL含量存在差异,由高到低依次是茎皮>叶柄>茎>叶,茎皮中的总GSL含量为53.58μmol/g,叶片的总GSL含量仅为38.26μmol/g。自然发酵过程中华容大叶芥菜的可溶性总糖、膳食纤维、蛋白质、脂肪、维生素C和总GSL含量都随发酵时间的延长而下降,总酸和氨基态氮含量则随发酵时间的延长而增加;新鲜芥菜乙醇提取物中可溶性总糖、脂肪、蛋白质、总GSL含量显著高于发酵芥菜乙醇提取物;新鲜芥菜乙醇提取物的氨基酸态氮和总多酚含量、挥发性成分的种类却显著低于发酵芥菜乙醇提取物,两者的总黄酮含量无显著差异。采用GC-MS技术从新鲜华容大叶芥菜中鉴定出7种主要的挥发性成分,其中异硫氰酸烯丙酯相对含量为92.83%。华容大叶芥菜经过发酵后产生大量挥发性成分,其在整个发酵过程中共鉴定出10类共70种化合物。新鲜华容大叶芥菜乙醇提取物鉴定出40种挥发性成分,发酵芥菜乙醇提取物鉴定出46种挥发性成分。采用HPLC-Q-TOF-MS技术从新鲜和发酵华容大叶芥菜乙醇提取物中共鉴定出45种化合物。其中GSL 20种,包括2-丙烯基GSL、3-丁烯基GSL、5-己烯基GSL等,新鲜芥菜乙醇提取物中有GSL20种,发酵芥菜乙醇提取物中GSL仅10种;两种芥菜乙醇提取物中发现黄酮类化合物共20种,包括槲皮素及其衍生物、山奈酚及其衍生物等,新鲜芥菜乙醇提取物中有8种,发酵芥菜乙醇提取物中有12种;新鲜芥菜乙醇提取物中未鉴定出有机酸,发酵芥菜乙醇提取物中发现有机酸成分5种。总之,新鲜芥菜发酵过程中,不仅营养成分发生了变化,其GSL类物质在发酵过程中发生降解反应生成酯类、含硫类、腈类化合物,黄酮类成分也同样发生了变化,如新鲜芥菜乙醇提取物中异鼠李素-3-O-二葡萄糖苷失去两个葡萄糖分子生成的异鼠李素,以上说明芥菜的发酵过程是不断降解大分子化合物,产生风味、滋味和生物活性成分等降解产物的过程。(2)华容大叶芥菜乙醇提取物对HCT116人结肠癌细胞的抑制作用及其机理研究采用MTT法、流式细胞仪、蛋白质印迹法和实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR)等研究了新鲜和发酵华容大叶芥菜乙醇提取物对人结肠成肌纤维细胞CCD-18Co和人结肠癌细胞HCT116的影响及其机理。结果表明:新鲜芥菜和发酵芥菜乙醇提取物对人正常结肠细胞CCD-18Co没有抑制作用,但均可抑制人结肠癌细胞HCT116的增殖和诱导人结肠癌细胞HCT116凋亡。芥菜乙醇提取物通过诱导细胞周期基因及相关信号蛋白(Cyclin B、Cyclin D1、Cyclin E)下调抑制人结肠癌细胞HCT116的增殖;芥菜乙醇提取物通过诱导细胞凋亡基因及相关信号蛋白(Caspase-3、Cleaved Caspase-3)的上调使人结肠癌细胞HCT116凋亡。两种乙醇提取物相比较,发酵芥菜乙醇提取物对人结肠癌细胞HCT116的抑制作用更强。(3)华容大叶芥菜乙醇提取物对RAW264.7细胞炎症的调控作用及其机理研究采用MTT法、蛋白质印迹法和实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR)等研究了新鲜和发酵华容大叶芥菜乙醇提取物对LPS诱导的炎症小鼠巨噬细胞RAW 264.7的调控作用及其机理。结果表明:新鲜芥菜和发酵芥菜乙醇提取物对RAW264.7细胞无毒性作用,但两种乙醇提取物都能有效抑制LPS诱导的RAW264.7炎症细胞的炎症反应。与模型组细胞比较,两种乙醇提取物干预后,显著降低了炎症细胞中的NO、细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及MDA的含量,提高了细胞中SOD和GSH-PX的活性,且细胞裂解液中TLR4及其下游NF-κB p65、COX-2、i NOS m RNA和蛋白的表达量都得到了回调,其中新鲜芥菜乙醇提取物组中NF-κB p65、COX-2基因表达水平已回调到了对照组的水平,表明新鲜芥菜乙醇提取物对小鼠巨噬细胞RAW 264.7炎症反应的抑制效果更好。(4)华容大叶芥菜乙醇提取物干预小鼠结肠炎活性及其机理研究通过DSS诱导C57BL/6小鼠建立溃疡性结肠炎模型小鼠,分别用新鲜芥菜和发酵芥菜乙醇提取物进行干预后,基于小鼠体征、组织病理学、代谢组学和肠道微生物多样性等研究了华容大叶芥菜乙醇提取物干预小鼠结肠炎的活性及其机理。结果表明:两种芥菜乙醇提取物均可从小鼠体征,疾病活动指数和结肠组织病理学方面改善模型小鼠的肠炎症状,同时还恢复了发炎小鼠结肠组织中的MPO,SOD活性,NO,炎性因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β、IL-17、IL-10、IL-4和IL-13)和短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、己酸和异丁酸)含量。此外,基于Illumina Miseq平台分析表明,新鲜和发酵芥菜乙醇提取物都能调节肠道菌群失调,炎症小鼠经芥菜乙醇提取物干预后,体内菌群结构向对照组小鼠体内菌群结构回调,一些具有争议性的菌群丰度下降,特别是Prevotellaceae、Bacteroides、Akkermansia等,一些有益微生物的丰度上升,特别是Lactobacillus、Bifidobacteria、Blautia等。而两种乙醇提取物对于一些菌如norank_f_Muribaculaceae、norank_f_Lachnospiraceae、norank_f_Muribaculaceae、Bifidobacterium、Blautia、Prevotellaceae_UCG_001、Akkermansia、Ruminiclostridium_5的调控有较大差异。采用UPLC-Q-TOF/MS方法对小鼠中粪便代谢物的变化研究结果显示,对照组和模型组小鼠粪便样品中共发现40个具有显著性差异的潜在代谢物。除发酵芥菜乙醇提取物组中脱氧腺苷外,其他代谢物在两种芥菜乙醇提取物的调节作用下向对照组小鼠粪便代谢物水平回调。通过KEGG拓扑分析最终得到影响值较大的5条通路途径,分别是赖氨酸的生物合成、类固醇激素的生物合成、甘油磷脂代谢、嘌呤的代谢、内酰胺的生物合成。最后,利用q RT-PCR和Western blot技术分别从m RNA和蛋白水平的检测结果表明,两种芥菜乙醇提取物阻断了TLR4-NF-κBp65-COX-2/i NOS途径,从而减轻了小鼠结肠炎的炎症,这与本文对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的调控机理一致。R语言相关性分析结果显示,肠道菌群和代谢物、生长因子及酶活之间互相影响,例如,双歧杆菌促进了异丁酸、异戊酸以及具有抗炎功效的脱氧腺苷显著升高,乳酸杆菌和抗炎因子IL-13、SOD、十二烷二酸呈显著正相关,劳特氏菌属和具有抗炎作用的丙酸呈显著正相关,抗炎代谢物γ-三烯生育酚和戊酸、己酸、丙酸的含量呈显著正相关,同时,TLR4-NF-κBp65-COX-2/i NOS通路的阻断又会减少促炎因子及NO的释放从而减轻炎症症状。整体而言,新鲜芥菜乙醇提取物对结肠炎的抑制作用比发酵芥菜乙醇提取物的抗炎效果更好,这可能与它们所检测出的不同的生物活性成分对肠道菌群和代谢产物的调控不同相关。总之,本文结果揭示了新鲜和发酵芥菜乙醇提取物对炎症小鼠的抗炎机制与对小鼠的肠道菌群、代谢产物和TLR4-NF-κBp65-COX-2/i NOS炎症通路调控有关,这对于合理利用芥菜来预防炎症引起的疾病至关重要。
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