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阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease,AD)是最常见的一种慢性神经退行性病变,临床症状主要以认知功能损害、记忆力减退和精神行为的改变为主。AD病理特征是β淀粉样蛋白(β amyloid,Aβ)沉积所形成的老年斑,以及tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。目前,AD尚缺乏有效的干预措施来阻止并逆转其进展。自噬(Autophagy)是一种主要的胞质内蛋白降解途径,其中细胞质内容物被称为自噬体的双层膜囊泡递送至溶酶体以降解。细胞内错误折叠等大分子被循环回细胞溶质中,作为ATP产生或蛋白质合成的底物,因此,自噬通过清除受损的蛋白质和细胞器,在维持细胞质内稳态方面发挥重要的内部维持作用。如果自噬功能异常,就会导致错误折叠蛋白不能及时而有效的清除,并沉积在细胞内,进而使神经细胞功能缺陷甚至死亡。研究表明,自噬调节功能障碍与AD等神经退行性疾病的发生和发展密切相关。自噬行为参与到人类的多种疾病过程,是一种新型且有前景的药物靶点,同时,自噬可以被多种中药或中药提取物所调节,提示自噬调节可能是中药治疗疾病药理作用的一个重要机制。mTOR信号通路是细胞自噬通路水平最重要的调节因子,在AD早期,即可检测到mTOR信号通路过度激活。临床研究表明,AD患者脑内自噬功能受到明显抑制,错误蛋白降解障碍并异常沉积,这可能是AD发生发展的重要病理基础环节。本研究以APP/PS1双转基因小鼠为AD模型,观察扶正祛邪方(Fuzheng Quxie Decoction,FQD)对APP/PS1双转基因小鼠神经细胞自噬功能的调节作用,并探讨其作用机制。明确FQD治疗AD的可能作用机制,为扶正祛邪方临床治疗AD提供实验依据。目的:观察FQD对APP/PS1双转基因小鼠认知功能和细胞自噬功能的影响,进一步探讨FQD通过自噬对神经细胞保护的作用机制。方法:实验用3月龄,雄性APP/PS1双转基因小鼠60只,通过计算机产生随机数字表将其随机分为5组:模型组(Model),雷帕霉素组(Rapa),扶正祛邪高剂量组(FQD-H),扶正祛邪中剂量组(FQD-M),扶正祛邪低剂量组(FQD-L)。用3月龄相同遗传背景的雄性C57BL/6小鼠12只为正常对照组(Control)。各组小鼠进行24周的灌胃干预。FQD-L、FQD-M、FQD-H和Rapa组分别给予相应药物干预,Control和Model组给予等体积蒸馏水。灌胃结束后,通过新物体识别、Morris水迷宫实验观察FQD对APP/PS1双转基因小鼠认知能力的影响。通过HE染色及尼氏染色实验观察FQD对APP/PS1双转基因小鼠脑组织病理形态的影响;免疫组织化学方法观察FQD对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ沉积的影响。透射电子显微镜观察各组中小鼠海马神经细胞超微结构形态的改变。Western blot法检测LC3B,p62和Beclin 1等细胞自噬相关的蛋白表达;mTOR,p-mTOR,p70S6K和4EBP1等mTOR信号通路相关的蛋白表达。Real-Time PCR检测自噬相关基因LC3B,p62和Beclin 1 mRNA的表达情况;mTOR信号通路相关基因mTOR,p70S6K和4EBP1 mRNA的表达。结果:1 FQD高剂量可改善9月龄APP/PS1双转基因小鼠的识别记忆能力。新物体识别实验结果显示:APP/PS1双转基因小鼠的新物体辨别明显少于对照组小鼠(p<0.01),说明9月龄的APP/PS1双转基因小鼠的识别记忆能力发生障碍;灌胃24周后,与模型组小鼠比较,扶正祛邪方高剂量组的APP/PS1双转基因小鼠对新物体辨别指数明显升高(p<0.05),而经雷帕霉素、扶正祛邪低剂量和扶正祛邪中剂量灌胃给药的APP/PS1双转基因小鼠对新物体辨别指数有升高的趋势,但无统计学意义(p>0.05),说明高剂量扶正祛邪方可以改善APP/PS1双转基因小鼠识别记忆能力。2扶正祛邪方可改善9月龄APP/PS1双转基因小鼠空间学习及记忆能力。Morris水迷宫实验定位航程训练结果可见,与第一天相比,所有小鼠的潜伏期均有所缩短,说明所有小鼠有一定的学习记忆能力。定位航程结果重复测量方差分析结果为:与对照组比较,模型组小鼠潜伏期明显延长(p<0.01),提示双转基因小鼠学习能力明显减低;与模型组比较,雷帕霉素组、扶正祛邪高剂量组潜伏期明显降低(分别p<0.05,p<0.01),提示雷帕霉素、扶正祛邪高剂量可提高空间学习能力,扶正祛邪低剂量组和扶正祛邪中剂量组与模型组比较潜伏期降低无统计学意义(p>0.05)。组内比较,与第1天潜伏期比较,对照组在训练第3天表现出明显的学习能力,潜伏期明显短于第1天(p<0.05);雷帕霉素和扶正祛邪高剂量对双转基因小鼠学习能力的改善出现在第2天,潜伏期明显短于第1天(p<0.05),但第2天潜伏期明显长于对照组;而扶正祛邪低剂量对双转基因小鼠学习能力的改善则出现第4天,潜伏期明显短于第1天(p<0.05);扶正祛邪中剂量对双转基因小鼠的学习能力未见明显改善(p>0.05)。同一天内,与对照组相比,模型组小鼠潜伏期在第2天以后均较长(p<0.01);与模型组小鼠相比,雷帕霉素、扶正祛邪高剂量组潜伏期分别于第4天(p<0.05)第3天(p<0.01)明显减短。空间探索结果可见:与对照组相比,模型组的穿台次数、原平台象限游泳路程比及原平台象限游泳时间比均明显减少(p<0.01)。与模型组相比,用药干预的各组穿台次数、原平台象限游泳路程比及原平台象限游泳时间比均有所增加,其中雷帕霉素组、扶正祛邪高剂量组穿台次数增加有统计学意义(p<0.05);扶正祛邪低剂量组原平台象限游泳路程比和原平台象限游泳时间比增加有统计学意义(p<0.01,p<0.05);扶正祛邪中剂量组原平台象限游泳时间比增加有统计学意义(p<0.05)。3扶正祛邪方可改善9月龄APP/PS1双转基因小鼠海马病理形态。光学显微镜下观察HE染色和尼氏染色后的小鼠脑组织,对照组小鼠海马CA1区细胞排列整齐、有序层次分明,细胞边界清晰,细胞形态规则,核仁清晰,细胞浆内的尼氏小体数量较多。与对照组相比,模型组小鼠海马CA1区细胞排列散乱无序、细胞层数减少,细胞间隙增大,出现形态不规则的细胞,细胞减少,甚至出现核仁消失;尼氏小体数量明显减少、甚至消失,染色变浅。与模型组小鼠对比,雷帕霉素、FQD-L、FQD-M和FQD-H组小鼠CA1区病理形态有不同程度的改善,细胞排列较整齐,细胞层数较加,细胞数量增多;胞浆染色较深,胞浆内可见较多的尼氏小体。4扶正祛邪方可降解9月龄APP/PS1双转基因小鼠海马Aβ1-42沉积Model组小鼠脑组织中沉淀斑块较为致密,着色较深,边界清楚;淀粉样斑块占海马面积的2.45%;与Control组比较,Aβ1-42的表达量显著增高,斑块面积和斑块总面积比明显增加(p<0.01)。Rapa组小鼠及FQD各剂量组小鼠脑组织中斑块较松散,Rapa组淀粉样斑块占海马面积的1.48%,FQD-L、FQD-M、FQD-H淀粉样斑块占海马面积分别为1.90%、1.55%、1.51%。与模型组小鼠比,Rapa、FQD-M、FQD-H组斑块面积和斑块总面积比明显减少(p<0.05),FQD-L组斑块面积和斑块总面积比减少不显著(p>0.05)。在中药干预后,Aβ1-42的表达随药物浓度增加而减少(P<0.05)。5扶正祛邪方促进APP/PS1双转基因小鼠海马细胞自噬APP/PS1双转基因小鼠的Beclin 1蛋白及mRNA表达水平,p62蛋白及mRNA表达水平水平显著高于对照小鼠,LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ转化量较对照组有所增加。给予FQD药物灌胃后,Beclin 1蛋白及其mRNA表达水平上调,LC3Ⅰ向LC3 Ⅱ的转化明显升高,p62蛋白及mRNA表达水平水平显著降低。6扶正祛邪方抑制mTOR激活APP/PS1双转基因小鼠的mTOR Ser2448位点磷酸化和mRNA表达水平均升高,4EBP1蛋白及mRNA表达水平明显低于非转基因小鼠,双转基因小鼠的mTOR通路被过度激活。p70S6k蛋白及mRNA表达水平无明显升高。给予FQD药物干预后,APP/PS1双转基因小鼠的mTOR Ser2448位点磷酸化和mRNA表达水平降低;4EBP1蛋白及mRNA表达水平明显升高,p70S6k mRNA表达水平比药物干预前降低,其蛋白表达水平有所降低。结论:扶正祛邪方可通过抑制mTOR蛋白的过度磷酸化降低mTOR信号通路的过度激活,进而促进细胞自噬,增加Aβ蛋白清除,改善APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力。