论文部分内容阅读
新疆药桑是一种半栽培半野生品种,是中国唯一一种天然44倍体(n=7)桑种质资源。药桑椹作为新疆维吾尔族传统的药食两用水果,含有大量的生物活性成分,如酚类、黄酮类、花青素等,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和抗动脉粥样硬化等生物学活性。已有许多文献报道药桑椹的提取物具有较好的抗炎活性,但具体的抗炎物质基础和潜在机制至今尚未阐明。因此,本研究通过体外实验确定药桑椹抗炎作用有效部位,并进一步探讨其抗炎作用机制。在此基础上,借助高效液相色谱-质谱(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)分析、网络药理学和分子对接挖掘有效部位潜在抗炎活性成分,主要研究内容如下:1.药桑椹有效部位的确定本研究对药桑椹甲醇总提物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水部分中的总多酚(Total polyphenols,TPC)和总黄酮(Total flavonoids,TFC)含量进行测定,并评估了它们的抗氧化和抗炎活性。结果表明,不同部位的TPC、TFC含量存在一定差异,乙酸乙酯部位的TPC和TFC含量最高,分别为399.67±3.58 mg GAE/g和155.79±5.17 mg RE/g。同样,乙酸乙酯部位在三种体外抗氧化模型中均表现出最强的抗氧化活性,1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt,ABTS)自由基清除能力的IC50值分别为0.18 mg/m L和0.64 mg/m L,铁离子还原能力(Fer-ric ion reducing antioxidant power,FRAP)当量为2.69 mmol Fe2+/g。与其他部位相比,乙酸乙酯部位表现出更强的体外抗炎活性,它能显著降低LPS(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞中一氧化氮(Nitric oxide,NO)的产生和抑制牛血清白蛋白变性,并呈现出剂量依赖性。因此,确定药桑椹乙酸乙酯部位为抗炎作用的有效部位。2.药桑椹有效部位抗炎机制研究以LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞为炎症模型,探讨药桑椹有效部位体外抗炎机制。结果表明,药桑椹有效部位可显著性抑制活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的释放和炎症因子白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达,同时抑制诱导性一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,INOS)、环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和5-脂氧化酶(5-Lipoxygenase,5-LOX)蛋白的表达及Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核转录因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)/丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)通路的活化,并激活核因子E2相关因子2/血红素酶1(Nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2/Heme oxygenase-1,Nrf2/HO-1)通路。3.药桑椹有效部位化学成分研究采用高效液相色谱-质谱联用技术对药桑椹有效部位的化学成分进行定性分析,并通过超高效液相色谱-二极管阵列检测法(Ultra performance liquid chromatography-photo diode array,UPLC-PDA)对其中主要活性成分进行定量分析。LC-MS结果通过Xcalibur软件辅助分析,共推断鉴定出56个化合物,其中黄酮类27个,有机酸类19个,脂肪酸类4个,香豆素类3个,其他类3个。主要活性成分绿原酸、咖啡酸、隐绿原酸、槲皮素、新绿原酸和阿魏酸的含量分别为8.69 mg/g、8.02 mg/g、6.81 mg/g、6.75 mg/g、5.97 mg/g、1.22 mg/g。4.基于网络药理学和分子对接挖掘药桑椹有效部位潜在抗炎活性物质利用网络药理学预测药桑椹有效部位潜在抗炎活性成分及作用靶点,将潜在活性成分与治疗炎症的核心靶点进行分子对接,选择结合能强的成分作为主要抗炎活性成分。结果表明,通过在线数据库获得药桑椹有效部位化学成分相关靶点547个,炎症相关靶点931个,其中共同靶点137个。基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析涉及生物学过程主要包括炎症反应的调节、细菌源分子反应、脂多糖、活性氧代谢过程等。京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集共获得150条通路,其中与炎症密切相关的5条是TNF、MAPKs、Toll样受体、NF-κB和花生四烯酸代谢通路。通过构建“成分-靶点-通路”网络,根据Degree值筛选出14个活性成分,分别为芥子酸、阿魏酸、柚皮素、咖啡酸、芹菜素、木犀草素等,13个关键靶点为ALOX5、PTGS2、EGFR、ALOX5、MMP9等。分子对接结果显示,14个活性成分与关键靶点ALOX5、PTGS2的对接分数高于阈值。漆黄素、异鼠李素、山奈酚和槲皮素与ALOX5对接分数较高,而异鼠李素、木犀草素、槲皮素、柚皮素与PTGS2的对接分数较高。综上所述,本研究阐明了药桑椹有效部位的抗炎物质基础及作用机制,为药桑椹的进一步开发利用提供理论依据。