研究目的:探讨人驱动蛋白分子Kif18A的各功能域在真核细胞中的定位。　　 研究方法:　　 1.构建驱动蛋白分子Kif18A野生型及各功能域(马达区、杆状区、尾区和马达区含部分杆状区)的绿色荧光蛋白表达质粒　　 (1)蛋白野生型表达质粒的制备　　 采用BIOZOL总RNA提取试剂从MCF7细胞中抽提总RNA,按照逆转录试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA。设计野生型Kif18A上下游引物,行PCR扩增。1.5％琼脂糖凝胶电泳,Biospin PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物,限制性核酸内切酶SalⅠ和EcoRⅠ酶切,酶切片段与酶切线性化处理的绿色荧光表达质粒pEGFP进行连接反应,转化感受态细胞大肠杆菌复制菌种Top10,筛选阳性菌落至含氨苄青霉素终浓度为50μg／mL的LB(Lurie—Bertani)液体培养基中培养过夜,使用Biospin DNA小提试剂盒提纯质粒。通过酶切,琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定质粒。　　 (2)蛋白各功能域表达质粒的制备设计各功能域上下游引物　　 以构建的野生型Kif18A蛋白表达质粒为模板,分别PCR扩增各功能域核酸序列,同1.2分别酶切连接构建绿色荧光蛋白表达质粒,经转化,筛选阳性克隆培养并质粒小提后,酶切电泳和测序结果鉴定质粒构建成功。　　 2.细胞培养及转染实验为检测质粒在真核细胞中的表达　　 人乳腺癌细胞MCF7接种于24孔板,每孔3×104个细胞,用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基,置于37℃,5％CO2孵箱中培养。次日当细胞融合度达70％左右时,用Lipofectamine2000转染细胞,每孔0.5μ L Lipofectamine2000+0.5μ g质粒+100μL无血清RPMI-1640培养基,对照组转等剂量pEGFP空载体。转染4～6h换成含10％胎牛血清的培养基,继续培养过夜。　　 3.表达产物的免疫印迹质粒转染过夜　　 刮取细胞,用蛋白质裂解液冰上裂解40min,4℃最高速离心后取上清,并使用BCA蛋白浓度检测试剂盒进行蛋白定量检测,各取相同蛋白量上样,7.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳稳流30mA,1.5h分离蛋白质,转膜400mA,2h,5％脱脂奶粉封闭1h,以抗GFP抗体孵育2h,辣根过氧化物酶偶联的IgG为二抗1h,增强化学发光剂(ECL)反应5min,暗室内显影。根据显影结果分析各条带分子量大小,检测各质粒的表达情况。　　 4.细胞爬片、转染及免疫荧光染色　　 MCF7细胞接种于加飞片的24孔板中,每孔3×104个细胞,同上1.4培养并次日做转染。转染过夜后置于荧光显微镜下观察,细胞表达绿色荧光比率达60％～70％。取出细胞飞片,用冷1:1甲醇／丙酮固定5min,磷酸盐缓冲液PBS保持5min。于含10％牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和0.1％Triton的PBS中封闭20min。PBS—Tx洗片3次,每次5min。加入鼠抗微管蛋白抗体孵育2min。PBS—TX洗3次,每次5min.加入德克萨斯红(Texas Red)标记羊抗鼠二抗避光孵育1h。将二抗完全吸出加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),避光染色10min,用PBS—TX洗2次,每次10min。在载玻片上滴加5μ L防淬灭剂,将飞片倒扣于上,指甲油封片。以上步骤均于室温进行。　　 5.荧光显微镜下观察各绿色荧光融合蛋白的具体亚细胞定位研究结果　　 有丝分裂间期,Kif18A蛋白分子的马达区绿色荧光沿微管分布,尾区在细胞核和微管上均有分布,杆状区则散在分布在胞质中；有丝分裂末期,Kif18A的马达区仍沿微管分布,而马达区含部分杆状区主要集中在中体部位。　　 结论及意义:Kif18A蛋白分子的马达区和尾区与微管共定位；尾区含核定位序列；马达区和杆状区共同作用才能使该蛋白在有丝分裂末期定位于中体。本实验着重研究了驱动蛋白分子Kif18A各功能域在真核细胞间期和有丝分裂后期的具体定位情况,讨论了各功能域对于该分子在细胞内定位的主要作用方式,为进一步探讨其在细胞分裂中的具体功能起指导作用。