异甘草酸镁对肝细胞模拟缺血再灌注损伤的保护作用和机制研究

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目的:观察异甘草酸镁(Magnesium isoglycyrrhizinate,MgIG)对肝细胞模拟缺血再灌注后细胞增殖、凋亡、炎症的调控作用,探讨MgIG对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及作用机制,为将来MgIG在肝脏缺血再灌注损伤中的应用提供实验基础和理论依据。方法:体外培养人肝细胞株HL-7702,当细胞处于对数生长期时:1.将细胞接种至96孔板,随机分为缺血再灌注组(ischemia-reperfusion group,IR组)及MgIG预处理组,待细胞贴壁后分别用不同浓度(0、10-2、10-1、1、10、100mg/ml)的MgIG预处理细胞24h,模拟缺血6h、再灌注4h后应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测MgIG对缺血再灌注肝细胞增殖活力的影响;2.将HL-7702细胞接种至培养板、培养瓶或载玻片上,随机将细胞分为IR组、低浓度组、中浓度组、高浓度组,待细胞贴壁后,分别用含有不同浓度的MgIG(0、0.1、1、10mg/ml)预处理24h,模拟缺血6h、再灌注4h后,取细胞或细胞的上清液用作以下实验:①应用吖啶橙/嗅化乙啶(AO/EB)染色观察细胞的凋亡情况;②用相应的试剂盒分别检测各组培养液中ALT、SOD、MDA、IL-1β、TNF-α的水平;③应用RT-qPCR法检测各组bcl-2、Bax、NF-ΚB基因mRNA的表达量。结果:1.MTT法结果表明:与IR组(0.227±0.013)相比,MgIG在0.1-10mg/mL浓度范围内能提高缺血再灌注HL-7702细胞的A值(0.285±0.017、0.320±0.008、0.341±0.019),差异有统计学意义(P<0.01);浓度过低时(0.01mg/ml),与IR组(0.227±0.013)相比,虽然也能提高缺血再灌注HL-7702细胞的A值(0.235±0.014),但差异无统计学意义(P>0.05);浓度过高时(100mg/ml),观察发现细胞全部漂浮,无活细胞;2.AO/EB染色结果显示,低浓度组细胞凋亡率(0.5763±0.0405)低于IR组(0.7124±0.0581),差异具有统计学意义(P<0.05),中、高浓度组细胞凋亡率(0.2866±0.0619、0.1261±0.0439)分别低于IR组(0.7124±0.0581),差异具有统计学意义(P<0.01);3.低、中、高浓度组上清液ALT含量(21.27±1.58、17.03±0.87、14.79±1.54u/L)分别低于IR组(24.65±1.22u/L),差异具有统计学意义(P<0.01);4.低、中、高浓度组SOD含量(16.99±1.25、20.22±1.35、23.76±0.99u/mL)分别高于IR组(12.52±1.80u/mL),差异具有统计学意义(P<0.01);5.低、中、高浓度组MDA含量(9.84±1.14、5.64±0.87、3.93±0.59nmol/mL)分别低于IR组(11.89±0.82nmol/mL),差异具有统计学意义(P<0.01);6.低、中、高浓度组IL-1β含量(33.34±1.30、30.51±0.76、28.35±1.24pg/ml)、TNF-α含量(58.75±4.05、40.04±4.74、29.22±2.31pg/ml)分别低于IR组(37.07±1.18pg/ml)、(66.43±3.28pg/ml),差异具有统计学意义(P<0.01);7.RT-qPCR结果显示低、中、高浓度组bcl-2基因mRNA的表达量(3.350±0.151、9.279±0.350、15.290±0.756)分别高于IR组(0.928±0.068),差异具有统计学意义(P<0.01),低、中、高浓度组Bax、NF-ΚB基因mRNA的表达量(0.743±0.035、0.265±0.065、0.119±0.019)、(0.597±0.062、0.248±0.067、0.141±0.029)分别低于IR组(0.945±0.063)、(0.962±0.034),差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:MgIG能减轻肝细胞缺血再灌注的损伤,其作用机制可能与MgIG能提高肝细胞增殖活力、抑制脂质过氧化、抑制炎症反应、减轻肝细胞凋亡等多种因素有关。
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