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一、模拟正畸牵张力刺激牙周膜细胞的成骨向分化研究目的:张应力诱导的骨形成是多种因素调控的复杂生物过程。牙周膜细胞是一群异质细胞群,在某些特定条件如正畸牵张应力刺激下能发生成骨向分化参与牙周组织改建。本研究的目的是对体外培养的牙周膜细胞施加循环牵张力刺激,观察牙周膜细胞的成骨向分化的表现,明确合适的加力条件。研究方法:首先分离培养人原代牙周膜细胞。使用体外循环性牵张力加载模型,对牙周膜细胞施加不同时长的牵张力,通过观察加力后细胞形态、细胞排列和基因表达的变化,明确合适的加力时间。进一步通过蛋白印迹实验检测细胞加力后成骨分化相关标志物的表达,茜素红染色检测加力后细胞在诱导条件下矿化结节的形成,从表象和分子水平观察牵张力诱导的牙周膜细胞成骨向分化。研究结果:与未加力的细胞相比,ALP,OCN的mRNA表达水平随牵张力作用时间的延长显著上调,细胞形态被逐渐拉长,细胞排列逐渐趋向于一致沿拉力方向。牵张力作用72h对牙周膜细胞的成骨向分化作用最明显,牙周膜细胞形成矿化结节的能力显著提高,成骨分化相关标志物表达显著上调。结论:使用该体外循环性牵张力实验模型,以6循环/分钟的频率,12%的拉伸形变率对牙周膜细胞施加牵张力72小时,可促进牙周膜细胞明显的成骨向分化。二、模拟正畸牵张力刺激牙周膜细胞成骨向分化中的miRNA表达研究研究目的:牵张力刺激牙周膜细胞后,细胞能将机械力刺激信号转化为胞内生物学信号促进成骨向分化。但是正畸牵张力作用的牙周膜细胞成骨向分化的分子调控机制尚未完全清楚。本实验的目的是探究循环性牵张力作用后,牙周膜细胞中miRNA的表达变化,探索与正畸牵张力引起的牙周成骨有关的miRNA及其与信号分子之间的网络关系。研究方法:分离培养原代人牙周膜细胞,对牙周膜细胞施加循环性牵张力,通过miRNA microarray和mRNA microarray建立牵张力作用的牙周膜细胞的miRNA表达谱和mRNA表达谱。使用实验信息学分析方法,对表达谱结果进行综合分析找出核心miRNAs并分析它们的功能。进而通过Real-time RT-PCR验证结果的可靠性。研究结果:microarray检测发现,与未加力的细胞相比,在加力72h的牙周膜细胞中有32个miRNAs和1000多个mRNAs的表达有显著性差异。信息学分析得到7个核心的表达下调的miRNAs,分析发现它们的靶基因中有26个与成骨细胞信号通路密切相关。Real-time RT-PCR结果与microarray结果一致。结论:建立了牵张力刺激的牙周膜细胞的miRNA表达谱和mRNA表达谱。信息学分析找出核心的miRNAs,这些miRNAs可能参与调控牙周膜细胞的成骨向分化。三、miR-195-5p在模拟正畸牵张力刺激的牙周膜细胞成骨向分化中的生物学作用研究研究目的:过去的研究发现miR-195-5p参与调控肌细胞机械力信号转导、成骨细胞分化,肿瘤发生发展等生理、病理过程。在牵张力作用的牙周膜细胞的miRNA表达谱中我们发现miR-195-5p是牵张力刺激后表达明显下调的miRNAs之一。miR-195-5p在牵张力作用下的牙周膜细胞成骨向分化中的表达模式和功能仍不清楚。本研究的目的是检测miR-195-5p在体内、体外正畸张应力作用下的牙周膜中的表达模式,探索miR-195-5p对牵张力刺激的牙周膜细胞成骨向分化的调控作用,并分析其调控该成骨向分化现象的分子机制。研究方法:Real-time RT-PCR 检测循环性牵张力加力不同时间后牙周膜细胞内的miR-195-5p的表达;Real-time RT-PCR和荧光原位杂交检测miR-195-5p在小鼠牙移动模型移动牙的牙周张应力区的表达。在体外培养的牙周膜细胞中过表达或抑制miR-195-5p表达,检测细胞OSX、OPN和OCN的表达水平以及细胞碱性磷酸酶的活性,茜素红染色检测诱导后矿化结节的形成。生物信息学预测miR-195-5p的靶基因,Western blot检测预测的靶基因在循环性牵张力作用下的牙周膜细胞中的表达水平。通过双荧光素酶报告实验检测miR-195-5p对靶基因的调控。在miR-195-5p过表达条件下分别过表达靶基因,检测二者之间的调控关系。研究结果:miR-195-5p在牵张力作用下的牙周膜细胞成骨向分化过程中表达显著下调;在小鼠牙移动模型移动牙的牙周张应力区的表达明显减弱。抑制miR-195-5p表达显著上调牙周膜细胞的成骨相关基因表达水平,并促进矿化结节的形成。过表达miR-195-5p显著下调OSX、OPN和OCN的表达,并抑制矿化结节形成。生物信息学预测的miR-195-5p的靶基因WNT3A,FGF2和BMPR1A在牵张力作用下的牙周膜细胞中表达显著上调。双荧光素酶报告实验证明miR-195-5p特异地结合于WNT3A,FGF2和BMPR1A的3’UTR抑制其表达。过表达WNT3A和BMPR1A可挽救miR-195-5p过表达对成骨向分化产生的抑制作用。结论:牵张力刺激通过下调牙周膜细胞中miR-195-5p的表达,导致miR-195-5p对WNT3A和BMPR1A mRNA的3’UTR的结合和翻译抑制作用减弱,上调WNT3A和BMPR1A的表达,从而促进细胞的成骨向分化。