研究背景皮肤损伤修复是通过表皮干细胞的分化及增殖实现的,典型的皮肤损伤修复开始于角质形成细胞从损伤边缘的迁移,随后的上皮再生过程还涉及损伤边缘毛囊细胞的增殖及迁移。总的来说,损伤修复过程在某种程度上类似于发育,而且同肿瘤细胞具有相似的细胞生物学特性以及分子变化。在皮肤的众多调控因子中,microRNA(mi RNA)是非常重要的一种。MiR-198近来被发现作为一种肿瘤抑制因子在机体内发挥调控作用,其通过抑制细胞的有丝分裂和相关的运动通路实现对细胞增殖的抑制,但是mi R-198在非肿瘤细胞或组织中对细胞增殖的抑制仍然少有研究。MiR-203是一种上皮组织特异性表达的miRNA,不仅参与皮肤发育,还具有抑癌和促凋亡作用。MiR-210是一种存在于多种组织细胞中的重要的缺氧相关mi RNA,其表达广泛参与了细胞的增殖、线粒体呼吸、DNA损伤修复、血管生成等病理生理过程。Mi R-34a是目前研究较多的肿瘤相关mi RNA。皮肤染毒的防治一直是芥子气(硫芥)研究的重点。角质形成细胞,尤其是基底层的表皮细胞是硫芥作用的主要靶细胞。硫芥损伤皮肤的机制尚未完全研究清楚,还没有见到miRNA参与硫芥损伤的研究。研究内容1、研究硫芥染毒人永生化角质形成细胞Ha CaT后,miR-198的表达变化。通过改变细胞内miR-198的表达研究其对HaCa T细胞增殖及细胞周期的影响,通过生物信息学预测手段寻找miR-198新的可能的结合靶点,用荧光素酶报告基因进行验证,并研究该靶点是否参与细胞增殖及细胞周期调控。研究mi R-198及其新靶点对HaCaT细胞的迁移和粘附能力的影响,利用生物信息学手段并结合实验研究对mmu-mi R-198进行预测和实验验证。2、研究硫芥染毒HaCa T细胞以及SKH-1无毛小鼠后,miR-203在细胞及染毒皮肤组织中的表达改变。在细胞水平上,研究mi R-203对细胞增殖和迁移能力的影响,及其应对硫芥损伤的能力。在动物模型中,研究mir-203的表达改变对小鼠皮肤切割伤、硫芥染毒损伤修复的影响,以及mir-203的表达改变是否对硫芥造成的骨髓和肠道损伤具有保护效应。通过对临床病例研究的收集整理,明确mir-203甲基化在肿瘤发生发展过程中的作用,分析mir-203作为肿瘤病人诊断和预后生存时间的预测标志物的可能性。3、研究硫芥染毒hacat细胞以及skh-1无毛小鼠后,mir-210在细胞及染毒皮肤组织中的表达改变。在细胞水平上,研究mir-210对细胞增殖和迁移能力的影响。在动物模型中,研究mir-210的表达改变对小鼠皮肤切割伤、硫芥染毒损伤修复的影响,以及mir-210的表达改变是否对硫芥造成的骨髓和肠道损伤具有保护效应。通过对临床病例研究的收集整理,明确mir-210作为肿瘤病人预后生存时间的预测标志物的可能性。4、通过对临床病例研究的收集整理,明确mir-34a作为肿瘤病人预后生存时间的预测标志物的可能性。研究结果1、硫芥染毒人永生化角质形成细胞hacat后,mir-198的表达出现显著上调。瞬时转染mir-198进入hacat细胞抑制了细胞增殖,细胞周期阻滞于g1期。生物信息学预测显示细胞周期蛋白d2(cyclingd2,ccnd2)是mir-198的一个新的靶点,荧光素酶报告基因检测结果提示,mir-198可以直接结合在ccnd2的3‘非编码区(3?-untranslatedregions,3‘-utr),下调细胞内ccnd2的mrna和蛋白表达。而细胞内ccnd2水平的下调显著抑制了细胞增殖,并导致了细胞周期的g1期阻滞。另外,mir-198促进了hacat细胞的迁移和粘附能力,而ccnd2的下调并未显示相同的促迁移作用。利用生物信息学手段对mmu-mir-198的预测没有取得预期的结果。2、mir-203在硫芥染毒的hacat细胞内表达变化并不显著,但在硫芥染毒小鼠皮肤组织中,mir-203在染毒后的不同时间以及不同部位均出现了显著的表达变化。mir-203在细胞水平上具有的促进细胞增殖和迁移的作用可能参与了小鼠皮肤组织中表皮细胞的损伤修复。在硫芥染毒小鼠的皮肤内上调mir-203的表达虽然并没有显著的促进皮肤损伤修复,但相应的下调mir-203的表达却显著的抑制了皮肤的损伤修复,而对于皮肤染毒的小鼠骨髓和小肠,mir-203的干预均出现了明显的保护效应。临床病例研究提示mir-203甲基化参与了部分肿瘤内mir-203表达的变化,而基于目前的研究现状,mir-203作为肿瘤病人诊断和预后生存时间的预测标志物,并不令人满意。3、mir-210在硫芥染毒的hacat细胞中表达出现显著上调,过表达mir-210抑制了细胞的增殖和迁移,而抑制mi R-210则出现相反的效应。硫芥染毒小鼠的皮肤组织中,mi R-210的表达在损伤后的不同时间均出现显著上调。在硫芥染毒的小鼠皮肤中下调miR-210的表达不仅显著的促进了皮肤早期以及中期的损伤修复,也保护了染毒小鼠的骨髓和小肠。临床的病例研究提示,miR-210在多种肿瘤组织中出现表达变化,其高表达预示了肿瘤病人较差的预后生存时间。4、Mi R-34a在多种肿瘤组织中均有显著的表达变化。多数的研究证实了其高表达可以预测肿瘤病人较好的预后生存,而也有部分研究提出了相反的结论。通过meta分析,我们认为miR-34a在部分肿瘤中的高表达可以预测肿瘤病人较好的预后生存。研究结论硫芥染毒人永生化角质形成细胞HaCa T后,mi R-198、mi R-210的表达出现显著上调,mi R-203的表达变化不显著。mi R-198通过靶向CCND2抑制了HaCaT细胞的增殖,引起了细胞周期阻滞。MiR-203促进了染毒HaCa T细胞的存活,对细胞迁移也有一定影响。Mi R-210抑制了HaCa T细胞的增殖以及迁移。硫芥染毒小鼠皮肤中,miR-203和miR-210都发生了显著变化,下调mi R-203抑制了小鼠皮肤的损伤修复,而下调mi R-210则促进了小鼠皮肤的损伤修复。临床病例分析提示,mi R-210和miR-34a均是较为理想的肿瘤病人预后生存预测的生物标志物,而mi R-203还不能作为肿瘤病人诊断和预测预后生存的生物标志物。