铜是植物生长发育必需的一种微量营养素,但铜过量会对植物产生毒害作用。随着人类活动的增强,如铜矿山的开采,导致了环境中铜污染。某些植物因长期适应高铜污染环境从而进化形成了一系列的铜抗性机制。海州香薷是一种铜矿指示植物,抗铜种群分布于湖北省大冶铜绿山的古老铜矿山上,而非抗铜种群分布于湖北红安县非铜污染的土壤,抗铜种群因具有高的铜抗性和修复铜污染土壤的潜力而备受关注。与非抗铜种群相比,铜胁迫下,抗铜种群具有更高的光合作用效率;更强的蒸腾作用;更高的根酸性转化酶活性;更多的根生物量分配量,但更少的根和苗铜含量等。为研究两种群生理差异背后的铜抗性分子机制,本文通过对铜胁迫下海州香薷抗铜种群和非抗铜种群的转录组比较,获得了铜抗性的相关基因;提出了海州香薷抗铜种群铜抗性分子机制可能涉及铜的避性机制、信号介导机制和能量代谢机制的共同作用。此外,转录组的分析结果显示铜胁迫下,抗铜种群和非抗铜种群根中细胞壁转化酶基因（CWINV）表达具有显著的差异性;该结果与实验室前期观察到的铜胁迫下抗铜种群根中细胞壁转化酶（Eh Ccw INV）活性及其基因表达显著性的高于非抗铜种群具有趋势上的一致性。对比两种群CWINV的编码区和启动子调控区,发现两者存在大量位点差异,特别是启动子的调控区。然而,我们最近研究结果证实两种群CWINV编码区的酶学特征没有显著性差异。为了进一步研究启动子调控区的差异是否影响CWINV的表达,通过构建和获得抗铜种群细胞壁转化酶全长启动子（Eh Ccw INVP）融合GUS报告基因（Eh Ccw INVP::GUS）和非抗铜种群细胞壁转化酶全长启动子（Eh Ncw INVP）融合GUS报告基因（Eh Ncw INVP::GUS）的转基因拟南芥及连续5′端缺失启动子的转基因拟南芥,分析了铜、干旱、盐、糖、植物激素处理对转基因拟南芥的响应,结果显示水杨酸调控Eh Ccw INVP和Eh Ncw INVP活性的显著性差异,并鉴定了一个270bp启动子片段为Eh Ccw INVP响应水杨酸的关键区段。研究结果丰富了对海州香薷抗铜和非抗铜种群细胞壁转化酶基因差异表达分子机理的认识。主要的研究结果如下:（1）证实了40.3μM铜处理24h,海州香薷抗铜和非抗铜种群具有不同铜抗性特征。在0.3μM-100.3μM铜浓度胁迫下,分别测量24h时与72h处理后两种群根的耐性指数（TI）,结果表明TI的变化趋势具有一致性。用40.3μM铜处理24h后,抗铜种群的根生长、根系活力和光合作用受轻微的抑制;而非抗铜种群受到强烈的抑制,但不是其致死浓度。在0.3-50.3μM铜处理24h后,铜含量在抗铜种群的根部和苗部均显著性低于非抗铜种群;此外,在0.3-25.3μM铜处理时,抗铜种群的铜转运系数显著性高于非抗铜种群。（2）比较分析了海州香薷抗铜和非抗铜种群根、苗的转录组,初步揭示海州香薷抗铜种群铜抗性的分子机制。7对真叶期海州香薷用40.3μM铜离子处理24h后,采集两种群的根和苗样品进行转录组测序及分析。共组装获得了120214个Unigenes;对获得的Unigenes基因进行NR、NT、Swiss Prot、KOG、KEGG、GO和Pfam等数据库的功能注释,能同时注释到所有数据库的Unigene数占比23.57%;被任意一数据库注释的基因数占比83.01%。对于物种注释（NR数据库）,注释到的物种与海州香薷所在的Engler植物分类系统分类单元相对应,证实转录组注释信息是相对准确的。进一步构建了种群内和种群间根部和苗部的差异表达基因（DEGs）的比较转录组,并对DEGs进行GO、KEGG富集分析。鉴定了抗铜种群中可能的铜抗性基因,主要涉及细胞壁相关基因31个、铜转运及铜结合基因的104个、植物激素传导过程中的差异表达基因14个、蔗糖分解与利用的基因58个。提出了海州香薷抗铜种群铜抗性分子机制可能包括铜的避性机制、信号介导机制和能量代谢机制的共同作用。（3）水杨酸（SA）调控海州香薷抗铜种群细胞壁转化酶启动子（Eh Ccw INVP）和非抗铜种群细胞壁转化酶启动子（Eh Ncw INVP）活性的显著性差异,揭示了转录水平抗铜和非抗铜种群CWINV差异表达潜在的分子机理。本文成功获得了Eh Ccw INVP::GUS和Eh Ncw INVP::GUS的启动子驱动GUS报告基因的转基因拟南芥。组织化学染色发现了Eh Ccw INVP和Eh Ncw INVP均能驱动GUS基因在转基因拟南芥的所有器官表达,表达呈脉管组织高于其它组织的特征。此外,测定了铜、干旱、盐、糖、植物激素处理对转基因拟南芥的响应,结果显示铜、干旱和盐不能诱导两种群启动子活性的显著性差异;葡萄糖和果糖能同时诱导两种群启动子活性显著性的（P＜0.05）增高;对于激素的处理,仅SA诱导抗铜种群启动子活性显著性的（P＜0.05）的增高,且与非抗铜种群启动子活性和阳性对照35S活性具有显著性的（P＜0.05）差异;这种显著差异的SA浓度范围为100-1000μM。在100μM SA处理24h后,观察到诱导GUS活性倍数的最高值为1.45倍;q RT-PCR进一步的确认了100μM SA处理6-12h时,GUS基因表达显著高于（P＜0.05）非抗铜种群及35S,并且在处理12h时观察到最高的1.94倍诱导表达。该研究结果提供了抗铜和非抗铜种群海州香薷的CWINV转录水平差异表达分子机理的新见解。（4）通过连续5′端缺失启动子转基因拟南芥的分析,鉴定了一段270bp的启动子序列为Eh Ccw INVP响应SA的关键区段。为确认Eh Ccw INVP启动子中响应SA的启动子区段和可能潜在的顺式作用元件,成功获得了Eh Ccw INVP::GUS的四个连续5′端缺失启动子C1（-1460 to ATG）、C2（-729 to ATG）、C3（-612 to ATG）和C4（-209 to ATG）融合GUS报告基因的转基因拟南芥。四个缺失启动子均能驱动GUS基因在转基因拟南芥的全株表达,同样具有脉管组织高于其他组织的特征。GUS定量分析表明,C1-C3启动子活性逐渐增大,C4活性最小。这些缺失启动子所含碱基序列较短,且活性相对较大,可为植物型启动子提供分子工具。四种缺失启动子转基因拟南芥SA处理的结果表明其GUS活性均不受SA诱导,因此,存在于C0而在C1中的缺失部分为响应SA的关键片段,这个长度为270bp的片段位于Eh Ccw INVP启动子中起始密码子上游的-1729到-1460 bp。比较Eh Ccw INVP和Eh Ncw INVP的响应SA关键片段,发现了两种群启动子有10个SNP位点,特别是抗铜种群启动子的CAAT-box和W-box元件插入的突变可能与SA的受诱导相关。