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随着人们生活水平的日益提高,牛奶早已成为一种非常重要的营养食品,而人们对牛奶品质的要求也越来越高。奶牛乳腺炎则是限制牛奶品质的一个重要的瓶颈。奶牛乳腺炎通常指的是由于病原微生物的感染而使奶牛乳腺组织产生的炎症的统称。乳腺炎的发生会导致奶牛产奶量和乳品质的显著下降,给奶牛养殖业造成严重的经济损失。本研究采用对金黄色葡萄球菌攻毒乳腺组织及攻PBS组织进行miRNA表达谱及转录组测序,筛选出其表达下调的miRNA和表达上调的目的基因,验证候选miRNA与免疫基因的靶向关系及其在乳腺上皮细胞系中的相关功能。1miR-145在牛乳腺上皮细胞系(Mac-T)中的功能研究为探究miR-145在Mac-T中的功能,我们在Mac-T中过表达和干扰miR-145,并检测其过表达和干扰效果。效果显著后应用Elisa和EdU检测Mac-T几种细胞因子的分泌水平变化及细胞增殖能力变化。结果显示:miR-145在牛乳腺上皮细胞系中过表达情况下可以显著降低白细胞介素12的分泌量和肿瘤坏死因子α的分泌量,显著增加干扰素γ的分泌量。与此同时,过表达miR-145后牛乳腺上皮细胞的增殖能力被抑制。2 miR-145靶基因的预测及靶基因FSCN1的识别由金黄色葡萄球菌攻毒的乳腺组织转录组数据结果,结合TargetScan、miRanda以及PicTar三个microRNA靶基因预测软件预测出数个候选靶基因。并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹检测(Western Blot)和双荧光素酶报告基因系统(Luciferase)多重验证筛选出miR-145的靶基因。结果显示:miR-145过表达或抑制表达后,FSCN1的mRNA表达均发生显著变化,并且miR-145过表达可以引起FSCN1蛋白表达的显著下调。FSCN1基因mRNA3’UTR存在确实的miR-145的靶向结合位点,并且下调FSCN1的活性。故miR-145可靶向调控FSCN1。3 FSCN1在Mac-T细胞中的功能研究采用RNA干扰法来对Mac-T细胞系中FSCN1的表达进行干扰,荧光定量PCR技术验证设计的siRNA敲降效果显著后,用Elisa检测Mac-T细胞系细胞因子的分泌情况以及EdU增殖实验检测细胞增殖状况。从而阐明FSCN1对Mac-T细胞系这两项功能的影响。结果显示:FSCN1的敲降可以使白细胞介素12的分泌量发生显著上调,而肿瘤坏死因子α的分泌量却显著下调。4全文结论金黄色葡萄球菌感染的乳腺组织,机体开启自我防护产生炎症,Bta-miR-145表达下调,从而释放了其对FSCN1基因的干扰作用,FSCN1表达上调促进乳腺上皮细胞增殖力图恢复细菌侵袭后损坏的乳腺细胞组织。