论文部分内容阅读
目的:通过观察中药醒鼻凝胶滴鼻剂干预变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)豚鼠鼻黏膜成纤维细胞对Fyn-STAT5信号通路的影响,寻找醒鼻凝胶滴鼻剂治疗AR的作用靶点,进—步阐明醒鼻凝胶滴鼻剂的作用机制,为提高AR的临床疗效提供实验依据。方法:应用卵白蛋白致敏法制备AR豚鼠模型,体外分离培养豚鼠鼻黏膜成纤维细胞,并采用免疫细胞化学法进行鉴定;采用不同浓度转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)干预成纤维细胞,应用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测TGF-[β1干预6h、12h、24h后的细胞增殖情况,以筛选出TGF-β1干预成纤维细胞的最佳条件。将豚鼠鼻黏膜成纤维细胞分为正常组(A组)、模型组(B组)、TGF-β1干预组(C组)、中药醒鼻剂干预组(D组)和西药雷诺考特干预组(E组),分别应用TGF-β1、醒鼻浸膏剂、雷诺考特分组干预C、D、E组的AR豚鼠鼻黏膜成纤维细胞;采用real-time PCR法检测各组成纤维细胞酪氨酸蛋白激酶Fyn、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、干细胞因子(stemcellfactor,SCF)的基因水平,采用Western blot法检测各组成纤维细胞的Fyn-STAT5信号变化。结果:1、免疫细胞化学染色结果显示,F3代豚鼠鼻黏膜成纤维细胞波形蛋白表达呈阳性,细胞生长曲线大致呈"S"形。2、MTT法筛选TGF-β1干预浓度结果提示,经25ng/mlTGF-β1干预后,细胞活力增长最明显,25ng/ml浓度干预6h后,细胞活力增长至129.356±4.354%;干预12h后,细胞活力增长至134.810±8.047%;干预24h后,细胞活力增长至143.824±4.773%(与25ng/ml 浓度干预 24h 后比较,P25ng/m1 6h<0.0 1,P25ng/ml 12h<0.05)。3、Real-time PCR检测结果显示,①B组中Fyn和SCF的mRNA表达水平均明显高于A组(P均<0.01),IL-10的mRNA表达水平明显低于A组(P<0.01);②C、D、E三组分别干预12h、24h后,Fyn和SCF的mRNA表达水平均显著降低(与同时间B组比较,P均<0.01),IL-10的mRNA表达水平显著升高(与同时间段B组比较,P均<0.01);干预48h后,Fyn和SCF的mRNA表达无明显差异(与B组比较,P均>0.05),C组的IL-10 mRNA表达无明显差异(P>0.05),而D、E两组仍明显升高(与B组比较,P均<0.01);③与C组比较,D组Fyn和SCF的mRNA表达水平在干预12h后均较高(P均<0.05),干预24h后均无明显差异(P均>0.05),干预48h后D组Fyn的mRNA表达水平明显低于C组(P<0.05),而SCF的mRNA表达无明显差异(P>0.05);IL-10的mRNA表达水平在干预12h和24h后D组均明显降低(P均<0.01),干预48h后D组明显高于C组(P<0.01);④同时间段相比,D组与E组中各基因的mRNA表达均无明显差异(P均>0.05)。4、Western blot检测结果显示,①B组中Fyn的蛋白表达水平明显高于A组(P<0.01),信号转导和转录激活因子 5(signal transduction and activator of transcription 5,STAT5)的蛋白表达水平明显低于A组(P<0.01);②C、D、E三组分别干预12h、24h后,Fyn的蛋白表达水平显著降低(与同时间段B组比较,C组P均<0.01,D、E两组P12h均<0.05,P24h均<0.01),STAT5的蛋白表达水平显著升高(与同时间段B组比较,C组P均<0.01,D、E两组P12h均<0.05,P24h均<0.01);干预48h后,Fyn和STAT5的蛋白表达均无明显差异(与B比较,C、D、E三组P均>0.05);③与C组比较,D组Fyn的蛋白表达水平在干预12h、24h、48h后均无明显差异(P均>0.05),STAT5的蛋白表达水平在干预12h后低于C组(P<0.05),而干预24h、48h后均无明显差异(P均>0.05);④同时间段相比较,D组与E组中各蛋白表达均无明显差异(P均>0.05)。结论:1、所分离培养的鼻黏膜细胞具有典型的成纤维细胞生物学特征。2、Fyn、STAT5和SCF均与AR的发生相关;Fyn通过激活FcεRI参与肥大细胞活化,SCF通过介导JAK2的活化使STAT5发生磷酸化;STAT5激活后—方面与Fyn形成免疫复合物,激活Fyn-STAT5信号通路,促进肥大细胞脱颗粒,参与AR免疫反应,一方面又通过自身转录因子抑制B细胞更新,阻碍IgE继续合成;IL-10在AR免疫反应中具有负向调节作用。3、TGF-[β1能够通过抑制Fyn-STAT5信号通路的活化来干预AR成纤维细胞,抑制AR体外免疫应答。4、醒鼻剂可能通过降低Fyn和SCF表达,阻碍FcεRI受体交联,抑制肥大细胞增殖和脱颗粒,减少组胺和各类炎性细胞因子的释放,同时通过上调STAT5,拮抗IgE合成,纠正TH1/TH2免疫失衡,从而抑制Fyn-STAT5信号传导通路,减轻AR成纤维细胞免疫反应;醒鼻剂还能通过显著上调IL-10,抑制各类促炎因子产生,降低气道炎症反应,调节机体免疫功能。