柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）是一种专性细胞内寄生的顶复门原虫,可引起鸡的球虫病,严重危害集约化养鸡业生产。当前鸡球虫病的防控主要采用化学药物配合活卵囊疫苗的技术手段,由此造成的抗药性、药物残留以及活疫苗潜在散毒风险等问题日益突出。由于鸡球虫复杂的生活史和生物学特性,人们至今对球虫的细胞生物学活性、入侵宿主以及抗药性等作用机制尚未全面了解,造成传统抗球虫药物的敏感性恢复、新型抗球虫药物及分子疫苗的研发面临巨大困难。近年来在对顶复门原虫自噬的研究中发现,通过药物的诱导或者抑制虫体的自噬可介导虫体发生程序性死亡,说明自噬对于寄生虫的细胞活性非常重要。鉴于此,本研究以E.tenella子孢子为研究对象,开展鸡球虫子孢子自噬方面的研究,以期揭示自噬对鸡球虫子孢子入侵活性及抗药性的作用机制,为新型抗球虫药的研发与抗球虫药抗药性的研究提供新的思路。1.E.tenella自噬标记蛋白Et ATG8的克隆表达及功能鉴定。本研究对E.tenella自噬相关基因（autophagy associated gene,Etatg8）进行了克隆、表达与亚细胞定位分析。结果显示,成功克隆获得全长为375 bp的Etatg8基因开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,编码124个氨基酸的Et ATG8蛋白,其三维结构与恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）Pf ATG8高度相似;Etatg8基因在虫体未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子及裂殖子4个发育阶段均有表达,但在未孢子化卵囊的转录水平显著高于其他3个阶段;Et ATG8蛋白在自噬诱导下呈点状聚集于子孢子及裂殖子胞浆中。结果表明,E.tenella具有与其他顶复门原虫、酵母以及哺乳动物等高度保守的atg8基因,Et ATG8蛋白在虫体自噬体膜的形成过程中起相同作用,可作为鸡球虫自噬研究的标记蛋白。2.E.tenella子孢子自噬的诱导、调节和检测。本研究以完全培养基培养的E.tenella子孢子为对照,利用营养缺陷型培养基、自噬调节剂处理子孢子建立自噬模型;利用免疫印迹（WB）、间接免疫荧光试验（IFA）及透射电镜（EM）等技术检测子孢子自噬体的形成及Et ATG8的表达。结果显示,饥饿或自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin）诱导的E.tenella子孢子可形成双层膜样自噬体结构;Et ATG8蛋白在自噬诱导下发生脂化,呈点状聚集于子孢子及裂殖子胞浆中,而3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine）可有效抑制自噬体的产生。结果表明,E.tenella与其他真核细胞一样具有保守的自噬机制。3.自噬对E.tenella子孢子入侵活性的作用研究。本研究利用化学发光法检测子孢子腺苷三磷酸（ATP）水平,利用台盼蓝染色法检测子孢子存活率,利用实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）⊿⊿CT法研究自噬对子孢子入侵活性的影响。结果显示,子孢子随着饥饿处理时间延长其存活率呈现明显下降趋势,但ATP水平却有所增加;而利用3-MA处理后ATP水平逐渐降低。子孢子经过RP诱导产生的自噬有利于对宿主细胞的入侵,相反3-MA可抑制子孢子的入侵活性。结果表明E.tenella在饥饿培养基诱导条件下可通过自噬机制保持能量平衡,自噬诱导剂诱导虫体产生的自噬则有利于其对宿主细胞的入侵。4.自噬在E.tenella对莫能霉素（Monensin）抗药性产生的作用研究。本研究通过台盼蓝染色法研究莫能霉素对E.tenella广州株敏感虫株（Mon S-GZ）及耐药虫株（Mon R-GZ）虫体活性的影响,利用WB、IFA及TEM等技术研究莫能霉素对两个虫株的自噬诱导作用。结果发现,相比Mon R-GZ株,莫能霉素可诱导Mon S-GZ株产生自噬并介导虫体死亡,而自噬抑制剂3-MA可有效阻断Mon S-GZ株产生自噬并拯救虫体存活。结果表明,莫能霉素诱导的自噬可作为介导球虫死亡的一种机制,同时也为解释球虫抗药性的产生提供了新的理论依据。