研究背景卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤。美国2019年死于卵巢癌的女性超过1.4万人,致死人数居恶性肿瘤的第五位,仅次于肺癌、乳腺癌、结直肠癌和膀胱癌;中国每年有大约2.5万女性死于卵巢癌,占恶性肿瘤死亡构成的前十位。75%的卵巢癌患者在确诊时已处于临床晚期,即使接受了以手术切除和铂类化疗为基础的标准治疗,仍有70%的患者最终会复发,根本原因是化疗不敏感和获得性耐药的产生。高级别浆液性癌(High grade serous ovarian cancer,HGSOC)占卵巢癌的75%,以p53功能缺失、DNA损伤修复缺陷和基因组不稳定为显著分子特征。超过一半的HGSOC患者存在同源重组(Homologous recombination,HR)修复缺陷,其中携有BRCA1/2突变的患者占大约35%——此二者在HR通路中发挥核心作用;另外6%-10%的患者则可能携带包括ATM、CHEK1、CHEK2、ATR等在内的其他至少10种HR基因突变。聚二磷酸核糖聚合酶抑制剂(PARP inhibitor,PARPi)是一种小分子靶向药,在HR修复功能缺陷的情况下使用可以引起“合成致死”(synthetic lethality)效应,主要被应用在BRCA 1/2突变的肿瘤中。基于多项国际多中心Ⅲ期临床试验的结论,目前已有数种PARPi被药物机构批准上市用于铂敏感的卵巢癌患者的维持治疗,使其治疗前景得到极大改观,但是伴随出现的PARPi原发性不敏感和获得性耐药成为PARPi应用当中亟待解决的问题。miRNA(microRNA)是家族庞大的一类非编码RNA,作为重要的转录调控因子在肿瘤发生发展当中的作用被大量研究印证,而依托转运介质将其类似物或靶向拮抗物转入人体组织有望使其成为恶性肿瘤或其他疾病的新型治疗手段,并在临床前期研究中初见成效。已有研究证实某些miRNA可能对于铂类或PARPi的治疗有协同作用,但多数研究以细胞实验为基础,距离真正实现临床转化还有很多不确定性。鉴于铂敏感同PARPi反应的相关性,本研究对肿瘤基因组库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中卵巢癌患者的miRNA表达谱和临床数据整合分析,发现了数个同HGSOC预后及铂敏感相关的miRNA并将miR-509-3作为研究对象,通过体外和体内细胞实验证实了 miR-509-3在HGSOC中发挥的PARPi增敏作用及机制。为了更贴合临床患者实际情况,我们构建了 HGSOC的人源化异种移植(patient-derived-xenograft,PDX)模型从临床前层面深入探求 miR-509-3 的PARPi增敏作用并浅析出了一套PARPi反应预测体系以待进一步大样本验证。具体研究内容包括:1.miR-509-3表达对HGSOC预后及增殖、侵袭迁移能力的影响。2.miR-509-3对HGSOC铂敏感性及PARP抑制剂敏感性的影响。3.miR-509-3通过靶向HMGA2和RAD51发挥PARPi增敏功能。4.miR-509-3在PDX模型中的PARPi增敏作用研究。第一部分miR-509-3表达对HGSOC预后及增殖、侵袭迁移能力的影响研究目的:绝大多数卵巢癌患者会对一线铂类化疗产生耐受从而严重影响患者的生存率和复发率,我们拟基于对TCGA卵巢癌患者miRNA表达谱和临床数据的生物信息学分析,筛选出同HGSOC铂敏感关系最密切的miRNA——miR-509-3,在独立队列中验证其表达量与HGSOC患者预后的关系,并初步探讨miR-509-3对HGSOC的增殖、侵袭迁移等肿瘤基本生物学行为的影响。研究方法:将TCGA中HGSOC患者分为铂敏感和铂耐药组,两组患者的miRNA测序数据使用DEGseq R包进行差异表达分析,取上调和下调最显著的miRNA绘制热图。RT-qPCR检测齐鲁医院126例HGSOC的miR-509-3表达量,利用t检验在TCGA和齐鲁医院两个独立队列中分别比较铂敏感和铂耐药患者的平均miR-509-3水平,Kaplan-Meier生存曲线和Log-rank检验比较miR-509-3高低表达组的OS或PFS差异。使用瞬转的方法在A2780、HEY和UWB1.289卵巢癌细胞系中过表达miR-509-3及NC后,行Transwell培养、MTT法细胞增殖实验、细胞周期检测和平板克隆形成体外验证miR-509-3对HGSOC增殖和侵袭迁移能力的影响。通过慢病毒转染HEY和UWB1.289构建miR-509-3过表达细胞系及NC后,行裸鼠腹腔注射成瘤在体内验证miR-509-3对HGSOC转移能力的作用。Western Blot检测miR-509-3上调后细胞中上皮间质转化(EMT)和周期相关蛋白的表达变化。研究结果:TCGA数据库的两类患者miRNA表达谱比较显示miR-509-3在铂敏感患者中表达上调。在TCGA和齐鲁医院病例中,铂敏感的HGSOC患者的miR-509-3表达均明显高于铂耐药患者,且miR-509-3高表达组的OS和PFS均较低表达组显著延长,miR-509-3是HGSOC患者OS和PFS的独立影响因素。细胞中过表达miR-509-3后,G0/G1期细胞占比升高而S期占比下降,相对细胞活性和克隆形成数也低于NC组,且周期相关蛋白CDK4、CDK6、CCND1和p21表达量均下调。体外实验中,miR-509-3过表达后穿过Transwell小室的细胞数目显著少于NC组;体内实验中,miR-509-3过表达细胞在裸鼠腹腔内形成的癌灶结节数目和质量显著低于对照细胞。Western Blot检测发现miR-509-3过表达后间质细胞标志N-cad表达降低,而上皮细胞标志E-cad表达升高,同时miR-509-3下调了 ZEB1、β-Catenin、Vimentin、Snail 和 Slug 的蛋白表达水平。结论:miR-509-3同HGSOC的铂敏感性和预后相关,高表达的miR-509-3能够延长患者的OS和PFS。miR-509-3对HGSOC的生长增殖和转移有抑制作用,在HGSOC中行使抑癌作用,因此是治疗的潜能靶点。第二部分 miR-509-3对HGSOC铂敏感性及PARP抑制剂敏感性的影响研究目的:铂耐药是致使HGSOC患者预后较差的罪魁祸首,前期我们已在临床数据中证实miR-509-3同患者的铂敏感相关,此部分旨在利用体外实验进一步印证其对HGSOC细胞铂敏感性的影响。同时,鉴于铂敏感性对PARPi反应性具有临床预测意义且两者均基于相似的“合成致死”的作用机理,本部分侧重研究在体内或体外miR-509-3对HGSOC的PARPi敏感性的影响,从而为提高HGSOC患者的PARPi反应性、逆转耐药提供新的潜在治疗策略。研究方法:通过MTT法分别绘制UWB1.289和HEY细胞系的miR-509-3过表达或对照细胞在顺铂或奥拉帕尼梯度浓度加药时的生长曲线,验证miR-509-3对HGSOC细胞的顺铂或Olaparib敏感性的影响。将构建好的HEY和UWB1.289的miR-509-3稳定过表达或对照细胞系在裸鼠皮下种植成瘤后,给予奥拉帕尼(50mg/kg)或相应浓度的DMSO腹腔注射连用14天后处死,比较不同处理组间所成瘤的平均大小和重量。研究结果:奥拉帕尼在HEY中的IC50显著小于UWB1.289(10uM-30uM vs 50uM-70uM)。过表达miR-509-3的HEY和UWB1.289细胞在面对不同浓度的顺铂或奥拉帕尼处理时的相对细胞活性均较同种NC细胞明显更低,生长曲线下降斜率更大、趋势更快。在体内实验当中,DMSO/miR-509-3组的肿瘤负荷显著低于未加处理的 DMSO/NC 组(HEY 0.76±0.05g vs 0.39±0.14g,P<0.01;UWB1.289,1.02±0.17g vs 0.48±0.26g,P<0.01);奥拉帕尼/NC 组和 DMSO/NC 对照组相比,奥拉帕尼单药明显抑制HEY和UWB1.289成瘤活性(HEY 0.76±0.05g vs 0.33±0.14g,P<0.01;UWB1.289,1.02±0.17g vs 0.41±0.14g,P<0.01);而奥拉帕尼/miR-509-3 组的平均肿瘤重量(HEY,0.12±0.06g;UWB1.289,0.15±0.008g)在四个处理组中最低(P<0.05)。结论:细胞系的BRCA状态并不能够准确预测其对PARPi的敏感性。miR-509-3对BRCA野生型和BRCA缺失型细胞的铂类和PARPi均有增敏作用,在逆转HGSOC患者的PARPi耐药、提高敏感性中有潜在的协同治疗的应用前景。第三部分 miR-509-3通过靶向HMGA2和RAD51发挥PARPi增敏功能研究目的:第一和第二部分的体内或体外细胞表型实验已经系统印证miR-509-3对于减缓HGSOC生长增殖、抑制侵袭迁移和提高对铂类及PARPi药物的敏感性有确切的作用,但是miR-509-3发挥这些抑癌功能的途径并不清楚。已知miRNA主要通过结合靶基因的3’ UTR区降解或抑制mRNA翻译行使作用,本部分拟对miR-509-3的靶基因和下游影响通路进行预测和验证,探寻其发挥生物学功能的确切机制。研究方法:通过在线数据库TargetScan 7.1和miRDB预测miR-509-3的候选靶基因。在A2780、HEY和UWB1.289细胞系中瞬时转染miR-509-3 mimics后,提取RNA和蛋白,分别通过RT-qPCR和Western Blot检测miR-509-3对靶基因mRNA或蛋白表达水平的调控;同时在体内成瘤的组织中,使用免疫组化检测靶基因在miR-509-3过表达肿瘤组织中的蛋白变化。根据TargetScan预测的靶基因mRNA 3’ UTR结合位点,分别构建3’ UTR的野生型和突变型pmirGLO载体,进行双荧光素酶系统实验。选取40例HGSOC临床样本,对靶基因mRNA和miR-509-3表达水平进行Pearson相关性检验。通过瞬转小干扰RNA(siRNA)后细胞功能实验,验证靶基因是否对HGSOC有PARPi增敏作用。利用蛋白免疫共沉淀(CoIP)深入寻找靶基因发挥PARPi增敏作用的直接下游。瞬转靶基因的cDNA/pENTER和miR-509-3 mimics/nc后进行细胞表型拯救和机制拯救实验,完善miR-509-3发挥PARPi增敏作用的机制通路。对miR-509-3过表达或对照细胞行不同剂量射线照射诱导DNA损伤后,Western Blot检测比较HR修复通路中相关蛋白激活水平差异,免疫荧光染色后在共聚焦显像中对比RAD51核荧光灶的形成情况。研究结果:TargetScan 7.1 和 miRDB 预测 HMGA2 和 RAD51 是 miR-509-3 的靶基因,二者的mRNA上有潜在结合位点。双荧光素酶系统实验证实,miR-509-3分别同HMGA2 3’ UTR的2个位点和RAD51 3’ UTR的2个位点能够直接结合。miR-509-3过表达后,HMGA2和RAD51在细胞RNA和蛋白水平以及体内成瘤组织中的表达水平均下调。而对40例临床标本的相关性分析中,HMGA2和RAD51表达均同 miR-509-3 水平呈负相关(HMGA2:Pearson r=-0.3844,P=0.01;RAD51:Pearson r=-0.3476,P=0.03)。由于RAD51在PARPi反应性中的作用已有充足研究,本部分仅对HMGA2的奥拉帕尼增敏进行了探讨。使用siRNA干扰掉HMGA2后,HEY和UWB1.289细胞对奥拉帕尼的敏感性均升高,且伴随着总ATM和活化ATM蛋白的下调,而Co-IP结果则显示HMGA2和ATM有直接结合的调控作用。在miR-509-3过表达细胞中转入HMGA2的cDNA质粒后,miR-509-3对细胞的奥拉帕尼增敏和侵袭抑制作用均被削弱,且ATM的表达水平也被上调。同样,瞬转RAD51的cDNA质粒后也起到了类似的表型拯救效果。将细胞暴露于梯度剂量的射线后,HR相关蛋白活化水平随射线剂量增加呈递增变化,而miR-509-3过表达细胞的HR相关活化蛋白表达被抑制,明显低于对照组。RAD51核功能性荧光灶的形成量也随miR-509-3的上调而减少。结论:HMGA2和RAD51是miR-509-3的下游靶基因。在HGSOC中,miR-509-3能够通过靶向下调RAD51和HMGA2-ATM轴干扰细胞的同源重组修复能力,进而增强PARPi的合成致死效用。miR-509-3在PARPi的协同治疗中具有潜在应用价值。第四部分 miR-509-3在PDX模型中的PARPi增敏作用研究研究目的:由于HGSOC具有高度异质性,传统的细胞系异种移植模型对药物进行筛选或临床前疗效评估存在着明显局限,并不能够准确地代表临床患者的实际情况。患者来源的肿瘤异种移植模型(PDX)是将癌症患者手术切除的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷动物体内,最大程度地保持原有的组织形态特点和分子生物特征,该模型对抗癌治疗的反应性同患者的实际疗效密切相关,在经典和新型抗癌疗法的临床前疗效预测中非常有应用潜力。因此,本研究拟通过构建HGSOC的PDX模型,从人源化肿瘤组织层面证实miR-509-3对PARPi的增敏作用。研究方法:用于移植的活体肿瘤块取自术中快速病理诊断为HGSOC的新鲜肿瘤组织(P0代),研磨为组织匀浆后经皮下注射种植于NCG小鼠体内,成瘤后进行冻存和传代,最终构建成能够稳定成瘤的PDX模型。治疗研究中使用9例PDX病例的腹腔种植模型,借助miR-509-3过表达腺相关病毒(AAV)和奥拉帕尼腹腔注射的方法对腹腔荷瘤鼠进行分组治疗,比较不同处理组小鼠的肿瘤负荷。利用全外显子测序(WES)分析纳入的9例PDX病例亲本组织(P0)的卵巢癌易感基因和DDR相关基因的突变情况。HE和免疫组化染色分别用来检测不同代数间PDX肿瘤的组织形态学特征以及p53、RAD51和HMGA2的表达情况。研究结果:同一亲本来源但不同代数间的PDX肿瘤组织具有相似的组织形态学表现。WES检测分析显示9例PDX病例的p53的突变率为88.89%(8/9),免疫组化结果显示所有病例均为p53表达强阳性。HR相关基因的突变率为44.44%(4/9),其中有 3 例为 BRCA1/2 突变(33.3%)。在4例HR基因突变病例中,奥拉帕尼的有效率为75%(3/4),其中3例BRCA1/2突变型病例对奥拉帕尼治疗有反应,而另一例携带非HR核心基因——LIG1基因突变的病例对奥拉帕尼治疗不敏感;在5例HR野生型病例中,奥拉帕尼的有效率仅为40%(2/5)。在初始RAD51(P2代)低表达(阳性率小于50%)病例中,奥拉帕尼的有效率为80%(4/5),远高于RAD51高表达病例的25%(1/4);而用药后的P3代组织为RAD51低表达的病例对奥拉帕尼的反应率为10.0%(5/5)。使用AAV-miR-509-3对荷瘤鼠腹腔注射治疗后,有两例(PDX1和PDX9)表现出了对奥拉帕尼的敏感性增强,一例(PDX8)对奥拉帕尼的原发耐药被逆转,此3例病例中P3代肿瘤RAD51表达均较P2代显著降低。结论:HR核心基因检测和RAD51功能性检测能够更准确地预测奥拉帕尼的反应性,从而指导HGSOC患者的临床用药决策。而且miR-509-3的联合应用能够增强PARPi在某些HGSOC患者中的杀伤效果,成为奥拉帕尼协同治疗新的潜在靶点。研究结论1.miR-509-3同HGSOC的铂敏感和良好预后相关。2.miR-509-3通过干扰HGSOC的HR修复功能发挥PARPi的增敏作用。3.在某些HGSOC的PDX病例中,miR-509-3同PARP抑制剂联合使用能够增强合成致死效果,具有协同治疗潜力。4.HR核心基因分析和RAD51功能性检测对于预测HGSOC的PARPi反应性有更高的准确性,具有指导临床患者药物选择的潜在应用价值。