转TiMYB2R-1基因小麦与转PgPGIP1基因小麦的分子检测及抗病性鉴定

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由Gaeumannomyces graminis var. tritici引起的全蚀病和由Bipolaris sorokiniana引起的根腐病是全球小麦生产的主要土传病害。培育抗病品种是防治上述病害最安全、经济、有效的方法。由于抗全蚀病、根腐病小麦种质资源匮乏,传统育种进展较为缓慢。基因工程的发展,为培育抗、耐全蚀病、根腐病小麦新品种提供了新途径。MYB转录因子在植物抵御生物和非生物胁迫反应中起重要作用,但对小麦全蚀病抗性反应的研究尚未见报道。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibitingproteins,PGIPs),能抑制一些真菌的内切多聚半乳糖醛酸酶(endopo1ygalacturonase,PG)的活性进而抑制这些真菌侵染,但对全蚀病菌抗性如何尚未见报道。中国农业科学院作物科学研究所张增艳课题从小麦近缘种中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)中克隆出一个R2R3类MYB蛋白编码基因TiMYB2R-1,构建了TiMYB2R-1的单子叶高效表达载体,通过基因枪介导法转入小麦推广品种扬麦12中,获得了转TiMYB2R-1基因小麦株系;人工合成了一个人参PGIPs编码基因PgPGIP1,构建了PgPGIP1的单子叶高效表达载体,通过基因枪法转入推广小麦品种扬麦18中,获得了PCR检测阳性的转PgPGIP1基因的小麦株系。本研究分析了转TiMYB2R-1基因小麦、转PgPGIP1基因小麦中外源目标基因在小麦中的遗传与转录表达情况以及转基因小麦的全蚀病、根腐病抗性,为评价TiMYB2R-1基因和PgPGIP1基因在小麦抗病性育种中的应用价值提供依据。获得以下研究结果:1、通过对转TiMYB2R-1基因小麦的PCR检测,明确了TiMYB2R-1基因的遗传稳定性。对转TiMYB2R-1基因小麦扬麦12的T4-T5代植株进行PCR检测,结果表明有3个转基因小麦株系(O1、O3、O5)的测试植株中外源TiMYB2R-1基因均呈阳性,说明在这3个转基因小麦株系中,转入的TiMYB2R-1基因能够稳定遗传,并达到纯合状态。2、对转TiMYB2R-1基因小麦进行分子检测和全蚀病抗性分析,明确了TiMYB2R-1基因的抗病功能。通过半定量RT-PCR、实时定量Q-RT-PCR以及Western blotting分析,证明这3个转基因小麦株系中,TiMYB2R-1基因能高水平地转录、表达,而且一些防卫基因如PR1a、PR17c、nsLTP、Gst22、Chit2、Chit3的表达量也得到提高。全蚀病抗性鉴定表明,与受体扬麦12相比,这3个转TiMYB2R-1基因小麦株系(O1、O3、O5)对全蚀病的抗性显著提高,其根部全蚀病菌Ggt的相对生物量显著降低。上述结果表明,TiMYB2R-1基因高表达可以增强转基因小麦对全蚀病的抗性。3、通过对转PgPGIP1基因小麦的PCR检测,明确了PgPGIP1基因的遗传稳定性。对转PgPGIP1基因小麦扬麦18的T1-T4代植株进行PCR检测,结果表明有4个转基因小麦株系(G1、G2、G3、G4)的测试植株中均能检测到外源PgPGIP1基因,说明在这4个转基因小麦株系中,转入的PgPGIP1基因能够稳定遗传。4、通过对转PgPGIP1基因小麦进行分子检测和抗病性分析,明确了该基因全蚀病抗性与根腐病抗性。对转PgPGIP1基因小麦扬麦18的T4代植株接种全蚀病菌或根腐病菌;对全蚀病菌或根腐病菌诱导的转基因小麦进行RT-PCR和Q-RT-PCR分析,结果显示,这4个转基因株系中PgPGIP1基因能够高水平转录表达;对这4个转PgPGIP1基因小麦株系进行全蚀病抗性和根腐病抗性鉴定,结果显示,与受体对照扬麦18相比,这4个转PgPGIP1基因小麦株系对全蚀病和根腐病的抗性显著提高,说明PgPGIP1基因正向调控植物抗病反应。
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