论文部分内容阅读
近年来我国养鸭业的集约化程度不断提高,鸭病毒性传染病也呈逐年上升趋势,我国规模化养鸭场疫病的共感染情况逐渐增多。鸭群中垂直传播性病毒的感染不仅能引起种鸭和肉鸭的免疫抑制和生长发育障碍,还可通过鸭胚垂直传播,使鸭胚在孵化过程中死亡,或者孵出弱胚,造成鸭胚孵化率低。给水禽养殖业尤其是种鸭养殖业带来了很大的困扰,严重制约养鸭业的健康发展。本研究采集山东不同地区孵化场的死亡鸭胚,使用PCR技术对鸭圆环病毒（Duck circovirus,DuCV）、新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus-related virus,NGPV）、新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）和禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAdV）四种垂直传播性病毒进行了共感染检测。利用检测出的阳性样本制备核酸探针,对采集的死亡鸭胚进行斑点杂交检测,记录不同批次的阳性率,统计分析采样群的共感染情况,并比对两种方法的检测结果。在此基础上对检测出的DuCV和FAdV的阳性样本进行基因分型,并对死亡鸭胚中的14株NDRV的σC基因序列进行扩增和序列分析,为鸭病的防控提供理论依据。本研究分为四个部分1、死亡鸭胚的采集与四种病毒的PCR检测2021年从山东省不同地区的8个种鸭群采集死亡鸭胚共308个,分别为济宁1（48个）、济宁2（47个）、德州1（48个）、德州2（36个）、淄博（39个）、菏泽（30个）、聊城（30个）和临沂（30个）。提取死亡鸭胚组织DNA和RNA,进行DuCV、NGPV、NDRV和FAdV的PCR检测。结果表明死亡鸭胚中四种病毒的个体检出率分别为16.56%（DuCV,51/308）、18.18%（NGPV,56/308）、46.43%（NDRV,143/308）、11.36%（FAdV,35/308）。死亡鸭胚个体二重感染的总检出率为19.15%（59/308）,三重感染的总检出率为4.55%（14/308）,未检测到四重感染。8个鸭群均存在病毒共感染,其中四重感染的群体检出率为62.5%（5/8）,三重感染的群体检出率为37.5%（3/8）。检测结果表明鸭群中普遍存在垂直传播性病毒共感染现象,由于DuCV和NDRV为免疫抑制性病毒,推测垂直传播性病毒的共感染可能是导致鸭群免疫抑制和生长发育障碍、鸭胚死亡以及孵化率低的重要原因之一。2、DuCV、NGPV、NDRV和FAdV核酸探针检测方法的建立及应用本试验分别将DuCV、NGPV、NDRV和FAdV基因序列中保守区域的一段长253bp、220bp、138bp、307bp的保守序列克隆后制备核酸探针。核酸探针的特异性试验结果表明,所制备的核酸探针特异性高,与其他病原核酸杂交呈阴性。核酸探针的灵敏性试验表明,DuCV、NGPV、NDRV、FAdV的核酸探针最低检出量分别为11pg、8pg、10pg和10pg。应用核酸探针对来自山东不同地区的308枚死亡鸭胚进行检测,结果显示DuCV、NGPV、NDRV和FAdV的检出率分别为11.04%（34/308）、12.66%（39/308）、42.53%（131/308）、和6.82%（21/308）。核酸探针与PCR检测结果对比发现,四种病毒的个体检出率均低于相应的PCR方法的个体检出率。由于核酸探针检测的灵敏度低于PCR检测方法,推测某些死亡鸭胚中这四种病毒的拷贝数较低。3、NDRVσC基因序列测定及分析为更好的了解死亡鸭胚中NDRV毒株与已有毒株的关系,本研究扩增了14株鸭胚源NDRV的σC基因序列,并进行进化树的构建及同源性分析。结果表明:14株NDRV与番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）和禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）分别处于不同的进化分支。14株分离株之间的核苷酸同源性为96.5%-99.6%,与NCBI上登录的NDRVσC基因序列的核苷酸同源性为92.9%-98.3%,与NDRV经典株TH11的核苷酸同源性为93.8%-97.2%,本研究分离株JN-48、JN-50、JN-61与TH11毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为95.3%-97.2%。4、DuCV和FAdV基因分型采用实验室已建立的检测两种基因型鸭圆环病毒双重PCR方法,对PCR检测呈阳性的51份DuCV样本进行分型鉴定。检测结果表明DuCV-1和DuCV-2的检出率分别为96.08%（49/51）和9.80%（5/51）。根据FAdV的Hexon基因分别设计FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11的特异性引物,经PCR检测35个FAdV阳性样本均为FAdV-4阳性,无其他FAdV基因型感染。基因分型检测结果表明,死亡鸭胚中DuCV-1和FAdV-4为优势基因型。本研究针对临床上常见的四种垂直传播性病毒,使用两种检测方法对死亡鸭胚中的病原核酸进行了检测,并分离扩增了NDRV的σC基因核苷酸序列,为种鸭场垂直传播性病毒的净化提供了流行病学依据。