1研究的目的与意义桑树(Morus alba L.)在中国的栽培历史已有近5000年,桑叶是其地上生物量最大的部分,为中国传统中药。桑叶自古就作为药茶和膳食补充剂被人们食用,其提取物在细胞和动物模型中被证明具有抗氧化和抗糖尿病活性,而这些作用与桑叶中的酚类化合物有密切关系。目前国家药典中关于桑叶的质量标准仅考察芦丁一个单体,这还不足以全面反映桑叶的特征化学成分组成,有必要进一步补充和完善考察的酚类单体种类,而且关于桑叶的脂质代谢调节作用大部分是基于动物水平的研究结果,其深入的分子机制研究还鲜有报道。本论文针对上述问题,开展桑叶酚类物质谱的研究,建立桑叶多酚质量标准,以研究脂代谢的主要细胞系3T3-L1为对象,研究桑叶多酚对脂质代谢紊乱的改善作用,以探讨桑叶多酚在脂质代谢紊乱方面的调控机制。由于桑树品种、成熟度和采收时间等会对桑叶多酚的含量造成较大影响,同时提取溶剂、料液比、提取温度等因素在桑叶多酚的提取得率方面也存在重要影响,因此本课题是在桑叶多酚提取工艺优化的基础上,进一步研究不同成熟度、品种、采收时间对桑叶抗氧化活性及酚类单体成分含量的影响,确定桑叶多酚的最佳成熟度、品种与采收时间,建立以桑叶多酚及其单体组成为核心的桑叶质量标准,筛选获得酚类物质组成最佳的桑树品种。以桑叶多酚提取物为研究对象,考察其对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响,跟踪细胞的脂质堆积的变化,探明桑叶多酚对相关脂质表型和基因表达的影响。研究结果可为开发桑叶辅助降血脂的功能性食品及药品提供理论依据。2研究方法本研究首先选用“粤椹大10”品种的桑叶为原料,采用响应面法在单因素实验基础上优化超声波辅助提取桑叶多酚得到最佳工艺;以“农桑12号”品种桑叶为对象在同一时间采摘其不同成熟度的桑叶样品,选择8个代表性品种,在不同生长时间采摘桑叶样品,对上述原料采用优化的最佳工艺提取桑叶多酚,高效液相色谱外标法检测各样品的酚类单体组成和含量,得到不同品种桑叶多酚物质谱及其动态变化规律;采用总酚含量、氧自由基吸收能力(orac)、dpph清除能力来评定抗氧化能力指标;用cck-8法检测桑叶多酚提取物对前脂肪细胞增殖的影响,油红染色法检测脂质堆积,酶法检测细胞上清液游离脂肪酸以及细胞内的甘油三酯和总胆固醇浓度,实时荧光定量pcr法检测前脂肪细胞分化过程中和脂代谢相关的过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(ppar-γ)、ccaat增强子结合蛋白-α(c/ebpα)、脂肪酸合成酶(fas)、脂联素(adiponectin)基因表达情况。3结果桑叶多酚最佳的提取工艺:乙醇浓度为70%、料液质量浓度为0.03g/ml、超声时间为60min。成熟度与桑叶抗氧化活性、酚类单体(绿原酸、安息香酸、芦丁和金丝桃苷)的含量呈负相关性;桑叶中主要多酚单体绿原酸、安息香酸、芦丁和金丝桃苷的含量和成熟度也呈负相关性;8个品种中“阿2”、“紫白4”和“抗青10号”的酚类单体含量总和较高,抗氧化活性也较高;不同采收时间对桑叶酚类物质组成与含量影响显著,10月份采收的桑叶酚类单体含量总和最高、抗氧化活性最强,其次是3月份,综合栽培与应用因素,10月份的“抗青10号”的桑叶是最佳原料;桑叶多酚提取物表现出良好的降脂作用,在60~70μg/ml的浓度时对细胞增殖有明显的抑制作用,在40~50μg/ml时可以极显著减少3t3-l1前脂肪细胞脂质堆积,抑制表观指标游离脂肪酸溢出、降低细胞中甘油三酯和胆固醇的浓度,下调影响细胞分化相关的基因PPARγ、C/EBPα、FAS、Adiponectin的表达。4结论本论文探讨了成熟度、品种和采收时间对桑叶酚类物质的单体组成、含量及抗氧化活性的影响,初步阐明我国代表性桑树品种的桑叶酚类物质谱的差异,明确了桑叶酚类物质在不同月份的动态变化规律。通过细胞实验阐明了桑叶多酚对3T3-L1前脂肪细胞的增殖、分化及脂质表型及其调控基因表达的影响,可为开发桑叶改善血脂紊乱功能食品和药品提供理论基础。