背景肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第五大致命的恶性肿瘤,恶性程度高、进展快、预后差,社会负担沉重。亚洲是HCC重灾区,而我国HCC的发病率和死亡率也呈上升趋势。尽管目前HCC基础和临床研究取得诸多成果,外科手术、介入治疗、射频消融等治疗方法使很多患者受益,但是HCC起病隐匿、早期症状不明显,晚期HCC十分常见且呈增加趋势,这些患者多伴远处转移,预后极差。同时,手术后复发也是HCC治疗的巨大挑战。因此,寻找更具潜力的生物标志物和治疗靶标将有助于HCC早期诊断和有效治疗。HCC是炎症相关性癌症的典型代表之一,肝脏中慢性炎症状态(以乙型肝炎病毒(Hepatitis virus B,HBV)感染常见)通过持续表达细胞因子和募集免疫细胞到肝脏,从而在肿瘤发生与发展中发挥作用。众所周知,遗传因素在HCC发生与发展中发挥重要作用,其中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是基因多态性的主要形式之一,在人群中频率大于1%。SNP可以很好反映不同个体间的遗传差异,还可能调控基因表达,进而影响不同个体对某种疾病的易感性。SNP已被广泛应用于人类各种疾病的研究中,其中肿瘤相关SNP在个体对癌症易感性中扮演重要角色。巨噬细胞是肿瘤中浸润最多的免疫细胞,肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是实体肿瘤中免疫浸润物的主要成分。TAMs在肿瘤发生、发展及预后中发挥的作用已被广泛研究。巨噬细胞一般被分为经典活化型(M1型巨噬细胞)和替代活化型(M2型巨噬细胞),一般认为TAMs属于M2型巨噬细胞,具有类似M2的标志物及促癌功能;但也有研究表明TAMs可以从M2样巨噬细胞向M1样细胞逆转,具有可逆性。TAMs这种复杂的生物学特点给临床研究和实践带来巨大挑战。然而,目前TAMs在肝癌发生发展中的角色仍未被完全阐明。CD68是重要的巨噬细胞特异性膜蛋白,也是泛巨噬细胞可靠的标志物。除了多种组织中定居的巨噬细胞,CD68还表达于肿瘤浸润巨噬细胞。CD206,又称巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor,MMR)或甘露糖受体C1型(MRC1)是一种具有噬菌和内吞作用的模式识别受体,主要表达于大部分巨噬细胞和树突细胞亚群,通常被用来鉴定M2型巨噬细胞。目前,CD68和CD206在人类疾病中的结构与功能已被广泛关注,但是有关CD68和CD206的基因多态性与人类HCC的易感性及预后是否存在关联、两者在HCC患者血清中表达水平尚未见文献报道。本研究从DNA、组织学、血清学三个不同层面比较系统研究了CD68和CD206在HCC中的表达及意义。目的本课题分为三个部分进行研究。第一部分:探究CD68和CD206三个位点(CD68 rs9901675、CD68rs9901673、CD206 rs941)多态性及其与HCC发病风险及患者预后的关联性,以期为HCC发病机制的研究提供新的切入点。第二部分:探讨CD68阳性巨噬细胞和CD206阳性巨噬细胞的数量和分布在HCC癌组织和癌旁组织中有无差异,评估其预后价值。第三部分:初步探讨HCC患者和健康对照者血清中可溶性CD68(a soluble form of s CD68,s CD68)和可溶性CD206(a soluble form of s CD206,s CD206)表达水平及其对HCC的诊断及预后意义,为HCC个体化临床诊治和长期随访管理提供有效的理论依据。方法第一部分:采用病例对照研究,连续收集符合条件的原发性HCC患者311例和健康体检者415名,采集研究对象的一般情况、临床及预后生存资料,同时收集全血标本、提取基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA),检测CD68和CD206基因三个位点的多态性,分析其与HCC发病风险、临床表型以及预后的关系。第二部分:选择268例行肝切除手术HCC患者进行回顾性研究。使用免疫组化方法检测HCC癌组织和癌旁组织中CD68阳性巨噬细胞和CD206阳性巨噬细胞,分析不同部位表达差异;采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristics curve ROC)评价CD68阳性和CD206阳性两种巨噬细胞对HCC的诊断价值;评估两者与HCC患者总体生存期和无瘤生存期的关系以及两者联合检测对HCC预后价值。第三部分:从第一部分研究样本中选取HCC术前患者123例和HCC术后患者60例、健康体检中心健康体检者60名,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中s CD68和s CD206水平,分析两者变化规律及其与HCC临床病理特征之间的关系,初步探讨两者对HCC的诊断价值及预后意义。结果第一部分:311例HCC患者和415名健康对照的SNP分析结果显示,CD68rs9901675多态性与HCC遗传易感性有关(OR=0.409,95%可信区间(confidence interval,CI)为0.206~0.812,P=0.009),该位点三种基因型GG、GA和AA的频率在HCC病例组为96.46%、3.54%和0%,对照组为92.53%、6.51%和0.96%,经调整性别年龄后差异具有统计学意义(P=0.019);但尚未发现CD68 rs9901673、CD206 rs941两个SNP位点与HCC易感性存在关联(P均>0.05)。生存分析结果显示,CD68 rs9901675是HCC术后复发的独立预测因子[HR(95%CI)=8.114(1.103~59.675),P=0.040],但是该位点多态性与HCC主要临床特征之间无显著相关性(P>0.05)。第二部分:(1)免疫组化检测结果显示:(1)CD68阳性和CD206阳性两种巨噬细胞在HCC癌旁组织中的表达量均显著高于癌组织(P均<0.05);(2)不同年龄、不同血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)水平、是否伴有门脉高压的HCC患者癌组织中CD68阳性巨噬细胞表达量不同(P均<0.05);而是否伴门脉高压或HBV阳性、不同AFP和肿瘤直径的HCC患者癌旁组织的CD68阳性巨噬细胞的浸润密度亦不同(P均<0.05);(3)CD206阳性巨噬细胞在不同性别、Child-Pugh分级患者的癌组织中表达水平不同(P均<0.05),而是否伴有肝硬化、不同血清总胆红素和TNM(tumor-nodes-metastasis)分期的患者癌旁组织中表达强度亦不同(P均<0.05)。(2)ROC曲线结果显示,癌内CD68诊断临界值(cut-off value)设定为71个/每高倍视野(high-power fields,HPF),曲线下面积(area under curve,AUC)为0.614,95%CI为0.547~0.678,敏感性52.2%,特异性70.7%,对HCC诊断有意义(P=0.003);癌旁CD68最佳临界值为87个/每高倍视野(high-power fields,HPF),AUC为0.599,95%CI为0.534~0.661,敏感性49.5%%,特异性70.5%,对HCC诊断有意义(P=0.008)。(3)Kaplan-Meier法比较生存曲线显示,癌内组织高表达CD206的HCC患者预后差,总体生存期(P=0.014)和无瘤生存期(P=0.003)均短于低表达组患者;而癌旁组织高表达CD68的HCC患者总体生存时间(P=0.020)和无瘤生存时间(P=0.018)则更长。Cox回归分析结果显示,癌旁高表达的CD68阳性巨噬细胞是HCC患者总体预后[HR(95%CI)=0.510(0.311~0.837),P=0.008]和术后复发[HR(95%CI)=0.529(0.299~0.935),P=0.028]的保护性独立预后因子;而癌内高表达的CD206阳性巨噬细胞则是HCC患者预后的独立危险因素:总体生存期[HR(95%CI)=1.792,(1.116~2.879),P=0.016]和无瘤生存期[HR(95%CI)=2.222(1.280~3.856),P=0.005]。(4)联合分析癌旁CD68阳性肿瘤巨噬细胞和HBV的结果显示,癌旁CD68阳性巨噬细胞或癌内CD206阳性巨噬细胞与HBV联合分析,HCC患者的无瘤生存期差异均具有统计学意义(P均<0.05),但是联合分析CD68阳性巨噬细胞与HBV对总生存期无明显影响(P=0.102)。第三部分:(1)HCC患者手术前和手术后血清s CD68和s CD206水平均明显高于正常对照组(P均<0.05),但是术前与术后血清s CD68和s CD206水平变化不明显,差异无统计学意义(P均>0.05)。同时,术前与术后s CD68/s CD206、术前s CD68与s CD206、术后s CD68和s CD206均存在相关性(P均<0.05)。(2)进一步分析发现,两者与HCC重要临床特征(HBV、肝硬化、门脉高压和血清AFP水平)存在密切联系(P均<0.05)。(3)CD68 rs9901675、CD68 rs9901673、CD206 rs941三个位点的不同基因型的HCC患者血清中s CD68/s CD206水平均无明显差异(P均>0.05)。(4)ROC曲线分析结果表明,当术前血清s CD206为20.52ng/ml时,可获得最大的曲线下面积,术前血清s CD206具有诊断HCC价值(P=0.032),而术前血清s CD68则无统计学意义(P=0.174)。(5)生存分析结果显示,术后血清高表达s CD68、伴有门静脉癌栓、术前白蛋白降低、碱性磷酸酶升高、总胆红素升高、伴有淋巴结转移或远处转移的HCC患者总体生存时间较短,差异均具有统计学意义(P均<0.05),进一步Cox回归分析结果显示,术后血清高表达s CD68是独立预后危险因素[HR(95%CI)=8.059(1.007~64.487),P=0.049]。而术前s CD68和s CD206以及术后s CD206对HCC患者预后未见统计学意义(P均>0.05)。结论1.CD68 rs9901675多态性与HCC患病遗传易感性有关,该位点G等位基因和GG基因型可能是HCC发病风险因素,也是HCC术后复发的独立危险因子。2.定量分析HCC组织中CD68阳性和CD206阳性巨噬细胞可以为HCC患者术后分层管理提供线索,为再驯化HCC微环境中巨噬细胞提供新思路新方法。癌旁高表达的CD68是HCC患者预后独立保护因子,而癌内高表达的CD206是HCC患者预后独立危险因素。联合分析CD68或CD206阳性肿瘤巨噬细胞与HBV感染可能进一步提高HCC术后复发的预测能力。3.检测HCC患者血清s CD68和s CD206水平有助于观察免疫状态,术前血清s CD206水平可作为HCC患者早期诊断潜在标志物,而术后血清s CD68可为HCC术后患者总体生存期提供预测,对HCC患者的临床诊断和预后评估具有重要临床价值。