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心血管疾病是威胁人类健康的重要因素之一。目前,心血管疾病已经超越肿瘤等慢性非传染性疾病,成为全世界死亡率最高的疾病,其死亡率达到了31%。尽管针对治疗和预防心血管疾病的研究和投入是所有慢性非传染性疾病中最昂贵的,其发病率和死亡率仍然每年在增长,提示其他重要发病因素的存在。大量临床和动物实验数据表明,孕期暴露于营养不良、缺氧等不利环境,会导致子代成年对心血管疾病的危险因素敏感性增高,从而更容易罹患心血管疾病,甚至诱发严重的心血管事件。我室在利用脂多糖和酵母多糖成功构建子代成年大鼠高血压模型的基础上,发现孕中期接受脂多糖刺激,与正常组相比,其子代大鼠成年后随年龄增长逐渐出现心肌纤维化和心肌重构,并导致舒张功能下降,这种心肌重构和舒张功能的下降可能与心脏NF-κB通路和心脏局部RAAS异常激活有关,但具体机制及其对子代成年心血管疾病易感性的影响仍不明确。目前,对于心脏疾病易感性的起因和机制研究主要集中在成年个体,因此,本研究结果可能扩大心脏疾病预防和治疗的时间窗,将防治心脏疾病的时间追溯到了生命早期。方法:1.孕鼠处理方案:SD孕鼠随机分为两个组(每组9-10只):对照组、LPS组。LPS组孕鼠分别在孕第8、10、12天给予腹腔注射LPS 0.79mg/kg,对照组孕鼠给予腹腔注射生理盐水。子代大鼠三周龄断奶,正常饲养至出生后第20周。2.子代大鼠处理方案:对照组和LPS组的子代大鼠20周龄时,分别随机分为4组(每组6只):LPS组子代大鼠分别给予皮下注射生理盐水,异丙肾上腺素(ISO)5mg/kg/day,皮下注射ISO+腹腔注射SB202190 0.4mg/kg/day,皮下注射ISO+口服NAC2.5mg/kg/day,分别定义为LPS+Ve、LPS+ISO、LPS+ISO+SB202190和LPS+ISO+NAC组,对照组子代大鼠采取与LPS组子代大鼠一致的处理方式,定义为Con+Ve、Con+ISO、Con+ISO+SB202190和Con+ISO+NAC组,刺激时间为两周。ISO急性刺激实验中,对照组和LPS组的子代大鼠20周龄时,分别随机分为2组(每组6只),一次性分别给予皮下注射生理盐水和ISO(5mg/kg)。3.高分辨率小动物超声影像系统评价子代大鼠心脏功能和心脏血流动力学。4.he染色法评价子代大鼠心肌细胞总体形态、心肌细胞大小;masson三色染色法评价心肌纤维化和胶原沉积。5.冰冻组织切片dhe荧光染色评价子代大鼠心脏活性氧簇表达。6.real-timepcr检测子代大鼠心脏左室组织中活性氧产生和清除相关基因(nox2、nox4、sod1、sod2)的mrna表达情况和心肌肥厚和纤维化相关基因(α-mhc、β-mhc、anp、bnp、col1a1、col3a1、mmp2、mmp9)的mrna表达。7.westernblot法检测子代大鼠心脏组织中p38、jnkmapk信号通路蛋白表达以及α-mhc、β-mhc等心肌重构相关蛋白表达。结果:1.孕期炎症刺激对子代成年大鼠心脏结构和功能的影响1.1与对照组子代大鼠相比,孕期炎症刺激子代大鼠左室室间隔厚度(ivst)显著增加、收缩末期左室内径(lvids)显著降低(p<0.05),左室中胶原容积分数(cfv%)、主要的胶原类型col1a1和及其降解酶mmp9表达增加(p<0.05),表明孕期炎症刺激子代大鼠存在明显的心肌重构。1.2与对照组子代大鼠相比,lps孕期炎症刺激子代大鼠心脏左室射血分数(lvef%)、左室短轴缩短率(lvfs%)显著升高(p<0.05),说明孕期炎症刺激子代大鼠存在明显心脏功能改变。2.孕期炎症刺激子代大鼠对iso刺激心脏损伤敏感性增加2.1iso刺激两周,正常对照组子代大鼠心脏重量指数(hmi)和左心室重量指数(lvmi)明显增加(p<0.001),但相同刺激下,孕期炎症刺激子代大鼠hwi和lvmi显著增加(p<0.001),且增加幅度明显高于相同处理的对照组子代大鼠(p<0.001)。2.2iso刺激两周,正常对照组子代大鼠左室与心肌肥厚相关的胚胎基因β-mhc表达降低(p<0.05)、anp表达增加(p<0.01)、bnp和非胚胎基因α-mhc表达无显著差异(p>0.05),α-mhc/β-mhc表达显著升高(p<0.01)。而孕期炎症刺激子代大鼠左室与心肌肥厚相关的胚胎基因β-mhc、anp、bnp表达显著增加(p<0.01);与正常对照组子代大鼠不同的是,非胚胎基因α-mhc表达显著降低(p<0.01),α-mhc/β-mhc差异无论在mrna水平和蛋白水平都显著降低(p<0.01),且低于相同处理的对照组子代大鼠(p<0.05)。这说明孕期炎症刺激子代大鼠对iso诱导的心肌肥厚敏感性增加。2.3iso刺激两周,正常对照组子代大鼠胶原容积分数(cvf%)、左室中主要存在的胶原类型col1a1、col3a1及其降解酶mmp2表达显著增加(p<0.01);相同刺激条件下,孕期炎症刺激子代大鼠胶原容积分数(cvf%)、左室中主要存在的胶原类型col1a1、col3a1及其降解酶mmp2表达也显著增加(p<0.01),且增加幅度高于相同处理的对照组子代大鼠(p<0.05)。说明孕期炎症刺激子代大鼠对iso诱导的心肌纤维化敏感性增加。2.4iso刺激两周,正常对照组子代大鼠心脏收缩功能指标左室短轴缩短率(lvef%)、左室射血分数(lvfs%)无显著改变(p>0.05)。与此相反,相同刺激条件下,孕期炎症刺激子代大鼠lvef%、lvfs%显著降低(p<0.001),lvef%、lvfs%分别降低13%和22%。提示iso刺激条件下,孕期炎症刺激子代大鼠心脏收缩功能显著降低。3.孕期炎症刺激导致子代大鼠对iso诱导的心脏损伤敏感性增加的机制研究3.1活性氧产生与清除失衡介导的孕期炎症刺激子代大鼠对iso诱导心脏损伤敏感性增加。3.1.1没有iso刺激的情况下,通过超氧化物阴离子水平荧光探针dhe染色显示,与对照组子代大鼠相比,孕期炎症刺激子代大鼠心脏组织dhe荧光染色强度有增加趋势,但无显著差异。iso连续刺激两周,对照组子代大鼠心脏中dhe染色荧光强度显著增加(p<0.01),孕期炎症刺激子代大鼠心脏中dhe染色荧光强度也显著增加(p<0.001),且显著高于相同处理的对照组子代大鼠(p<0.001)。3.1.2与正常对照组子代大鼠相比,孕期炎症刺激子代大鼠左室中促进ros生成的nadph氧化酶(如nox2、p47phox)mrna表达显著增加(p<0.05),nox2在蛋白水平表达也有增加趋势,说明孕期炎症刺激子代大鼠存在ros激活。iso刺激两周后,对照组子代大鼠左室中促进ros生成的nadph氧化酶(如nox2、p67phox)mrna表达显著增加(p<0.01),nox4和p22phoxmrna表达也有增加趋势,但无显著差异;相同刺激条件下,孕期炎症刺激子代大鼠左室中促进ros生成的nadph氧化酶(如nox2、p67phox、nox4和p22phox)mrna表达也显著增加(p<0.01),且显著高于相同刺激的对照组子代大鼠(p<0.05or0.01)。nox2在蛋白水平的表达趋势与mrna水平一致。3.1.3与正常对照组子代大鼠相比,孕期炎症刺激子代大鼠左室中促进ros清除的sod1、sod2、sod3、catalasemrna表达显著增加(p<0.05or0.01),sod1蛋白表达水平也显著增加(p<0.05)。iso刺激两周后,对照组子代大鼠左室中促进ros清除的sod1、sod2、sod3、catalasemrna表达显著降低(p<0.05or0.01),而孕期炎症刺激子代大鼠左室中促进ros清除的sod1、sod2、sod3、catalase和gpx-1mrna表达也显著降低(p<0.01or0.001),且低于相同刺激对照组子代大鼠的趋势,但无显著差异。sod1和sod2蛋白表达水平与mrna水平一致。3.1.4抗氧化剂nac能降低iso导致的孕期炎症刺激子代大鼠心肌纤维化,提高心肌收缩能力。3.2p38mapk激活介导的孕期炎症刺激子代大鼠对iso诱导心脏损伤敏感性增加。3.2.1与正常对照组子代大鼠相比,孕期炎症刺激子代大鼠左心室p-p38表达显著增加(p<0.05),说明孕期炎症刺激子代大鼠左室中p38mapk被激活。3.2.2无论是否用iso刺激,孕期炎症刺激子代大鼠左室p-p38表达比相同刺激的正常对照组子代大鼠显著增加(p<0.05)。iso刺激两周后,正常对照组和孕期炎症刺激子代大鼠左室中p-p38表达都无显著改变(p>0.05)。3.2.3考虑到p38激酶激活的周期性特性,我们进行了iso急性刺激实验。在iso急性刺激实验中,对照组子代大鼠左室p-p38表达显著升高(p<0.05),孕期炎症刺激子代大鼠左室p-p38表达显著升高(p<0.01),且比相同处理的对照组子代大鼠升高更明显(p<0.01)。3.2.4p38活性抑制剂sb202190能降低iso导致的孕期炎症刺激子代大鼠心肌肥厚、心肌纤维化,提高心肌收缩能力。3.3ros与p38mapk相互作用放大了孕期炎症刺激子代大鼠对iso诱导的心脏损伤作用3.3.1抗氧化剂nac能降低孕期炎症刺激子代大鼠iso刺激组左心室中p-p38表达(p<0.05)。3.3.2p38活性抑制剂sb202190降低孕期炎症刺激子代大鼠iso刺激组左室中与ros生成有关的nadph氧化酶nox2、p67phox、p22phoxmrna水平表达(p<0.01),提示ros和p38mapk并不是简单的上下游通路关系,可能通过ros-p38mapk相互作用,共同促进iso刺激条件下,孕期炎症刺激子代大鼠的心脏损伤。结论:1.孕期炎症刺激导致子代成年大鼠对iso诱导的心肌损伤敏感性增加,主要表现为左心室肥厚,心肌纤维化程度加重,左室收缩功能显著降低。2.活性氧生成与清除失衡是导致孕期炎症刺激子代成年大鼠对ISO诱导的心肌损伤敏感性增加的机制之一,抗氧化剂NAC降低ISO诱导孕期炎症刺激子代成年大鼠的心肌纤维化损伤程度,提高心脏收缩功能。3.p38 MAPK激活是导致孕期炎症刺激子代成年大鼠对ISO诱导的心肌损伤敏感性增加的另一可能机制,p38活性抑制剂SB202190降低ISO诱导的孕期炎症刺激子代成年大鼠心肌肥厚、心肌纤维化损伤程度,提高心脏收缩功能。4.ROS与p38 MAPK相互作用进一步加剧了ISO对孕期炎症刺激子代大鼠的心脏损伤作用。