论文部分内容阅读
甲型流感周而复始的爆发，都给人类健康和社会经济带来巨大损失。由于甲型流感病毒因多种复杂原因很容易发生基因重排，其毒株型会随年份与季节变化而改变，人类有目标或针对性地预防流感是非常困难的，这给疫苗研发带来了很大的挑战。 目前使用的针对流感病毒的疫苗主要是三价灭活的病毒疫苗，其生产周期长，且必须被定期重造以适应接下来可能引起流感的毒株亚型，难以满足流感大流行突发需求。因此，设计一种能够对大部分的流感病毒起预防作用的疫苗，即通用流感疫苗、广谱疫苗，或“万能”流感疫苗，将成为目前最具有吸引力的流感疫苗研究方向。 本课题通过选取流感病毒各亚型间保守性的抗原表位来制备通用流感疫苗。多肽表位是蛋白抗原产生免疫性的最短序列，能精确的控制免疫反应。主要选取了HA、NP、M2三种蛋白中的抗原表位。HA的抗原表位为GLFGAIAGF，NP的抗原表位为TYQRTRALV，M2的抗原表位为MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD。但是抗原表位单独作用产生的免疫活性低，抗原表位与HBc共同作用即可显著增强抗原表位的免疫活性。 构建并成功表达纯化了HA-M2e-HBc，M2e-HBc，HBc，3M2e-HBc四种蛋白纳米颗粒形式的疫苗，经透射电子显微镜都观察到了三十纳米左右的蛋白纳米颗粒样结构。并将纯化得到的HA-M2e-HBe，M2e-HBc，HBc，3M2e-HBc四种蛋白纳米颗粒形式的疫苗分别与弗氏佐剂共同免疫小鼠。经HBc(40μg)、3M2e-HBc(30μg)和3M2e-HBc(40μg)三组蛋白分别免疫的小鼠外周血流式细胞分析结果显示，小鼠外周血淋巴细胞中CD-4+T细胞的含量都远远高于CD8+T细胞的含量。3M2e-HBc（40μg）蛋白免疫小鼠后CD4+ T/CD8+T比值明显高于经3M2e-HBc(30μg)蛋白免疫小鼠后CD4+T/CD8+T的比值。说明HBc和3M2e-HBc都发挥了一定的免疫活性。 在蛋白通用流感疫苗的基础上，构建了DNA通用流感疫苗。成功构建了pcDNA3.1-egfp、 pcDNA3.1-HA-M2e-HBc-egfp、 pcDNA3.1-M2e-HBc-egfp、pcDNA3.1-HBc-egfp和pcDNA3.1-3M2e-HBc-egfp五种带有荧光蛋白基因的重组质粒和pcDNA3.1-HA-M2e-HBc、pcDNA3.1-M2e-HBc、pcDNA3.1-HBc和pcDNA3.1-3M2e-HBc四种不带荧光蛋白基因的重组质粒。通过荧光分析和Western Blot初步验证了其在HEK293T中的表达情况。但其作为DNA通用流感疫苗的活性还有待研究。