转录因子Sox2是Sox基因家族的一员,其包含了一个DNA结合HMG结构域,能与不同转录因子、多种DNA启动子或增强子,以及Micro RNAs互相作用,在受精卵发育、胚胎发育、干细胞多能性维持、衰老与疾病发生中展示了多种生物学功能。然而,对鸡胚发育过程中Sox2组织分布与定位,以及时空表达模式知之甚少。本研究的目的是,改良冷冻切片制作程序,以“广西三黄鸡”鸡胚为实验材料,在其发育不同时间点,以免疫组织化学染色法(IHC)检测大脑、中脑、小脑、肺脏和睾丸组织Sox2分布与组织定位。与此同时,应用实时荧光定量PCR(q-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)检测这些组织中Sox2基因时空表达模式。1.冷冻切片法改良及其在鸡Sox2组织细胞定位中的应用多聚甲醛固定和蔗糖脱水后的脑、肺和睾丸组织,在切片之前,利用OCT包埋剂进行浸润预包埋,镜下观察拟改良冷冻切片、常规冷冻切片与石蜡切片的HE染色和免疫组织化学染色(IHC染色)差异,并利用Image J和Graph Pad软件对不同方法制作的冷冻切片内冰晶数量进行量化和统计分析。随后应用此改良法检测Sox2免疫阳性细胞在鸡胚脑、肺脏和睾丸组织中细胞定位。结果表明:切片前使用OCT包埋剂充分浸润组织6 h,可显著的提高冷冻切片质量;与常规冷冻切片法相比,用改良法制作的睾丸和脑组织冷冻切片结构更加清晰,冰晶形成数量大幅降低(P<0.01),免疫染色定位更清晰;与传统石蜡切片相比,改良法制作的肺组织冷冻切片质量尤佳。免疫组织化学显示鸡胚大脑、中脑、小脑、肺脏和睾丸组织均为Sox2免疫阳性。其中,小脑各组织层均发现Sox2免疫阳性细胞;中脑视顶盖表面灰质纤维和中央白质层有Sox2免疫阳性细胞散在;大脑组织Sox2阳性信号位于大脑皮质细胞和侧脑室神经上皮;肺脏组织Sox2阳性信号定位于初级支气管粘膜上皮和次级支气管上皮及粘膜下腺体细胞;睾丸组织生精小管内的生精细胞以及间质中的少量间质细胞为Sox2免疫阳性细胞。2.Sox2在鸡胚发育过程中的时空表达将鸡胚胎孵化至四个不同时段(7 d、11 d、15 d、20 d),利用CDH1基因鉴定鸡胚胎性别后,采集雄性鸡胚的大脑、中脑、小脑、肺脏和睾丸组织,用实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹法检测Sox2在这些组织中的时空表达。结果表明:所有脑组织中,Sox2 mRNA均在发育至15 d时达到最高表达水平,而Sox2蛋白在不同发育时间点的表达模式与Sox2 mRNA不同;肺脏中,Sox2 mRNA和蛋白均随着发育的进行逐渐降低;睾丸中,Sox2mRNA在11 d时下降,随后升高并保持稳定,Sox2蛋白在睾丸的各个发育阶段表达量保持恒定。结论:本研究为免疫组织化学研究提供了冷冻切片新方法。Sox2蛋白在鸡睾丸和肺脏的组织定位与哺乳动物类似,在脑组织中,尤其是中脑视顶盖的分布比哺乳动物更加广泛;贯穿整个胚胎发育期,Sox2 mRNA和蛋白在脑、肺脏和睾丸中持续表达,表明Sox2参与了鸡胚中枢神经系统发育、肺脏的形成和肺内气道分支以及精子的发生。本研究为全面认识Sox2在鸡胚胎发育中的作用提供了基础资料。