中药配伍是方剂发挥药效的关键,中医的辨证论治正是通过方剂的配伍变化来实现的。中药复方配伍规律及药效物质基础研究是解决方剂关键问题的突破口,是国家现代中医药研究领域重点组成内容之一。探求中药及其复方药效物质基础已经成为当今中医药学界关注的重点问题。黄芪-三七药对以益气药与活血化瘀药配伍,临床较广泛应用于心绞痛、心肌梗塞、慢性肾炎等疾病,但未见黄芪-三七配伍规律及药效物质基础的系统性研究。我们采用UPLC/ESI-LTQ-OrbitrapMSn组合质谱技术,重点对黄芪-三七药对中的黄芪异黄酮类、黄芪皂苷类、三七皂苷类化学结构进行化学成分鉴定及质谱裂解规律研究。我们将这种分析技术与方法,还应用于一种含有黄芪的中药复方—补脾益肾方的物质基础研究,对苯丙苷类、党参炔苷类、二苯乙烯苷类、蒽醌类等主要化学结构类型进行质谱学研究,以阐明UPLC/ESI-LTQ-Orbitrap MSn在中药药对及复方研究领域良好的应用前景。此外,针对中药复方中化学成分复杂,含量差异大等特点,对两种组方进行多成分定量研究,从有效成分层面研究其配伍、浓缩干燥工艺影响药效物质的动态过程。采用基于LC-MS技术进行多成分定量的方法,考察黄芪-三七药对配伍前后及不同配比条件下,黄酮类及皂苷类成分的溶出变化情况。通过建立HPLC-MS测定化学成分的定量检测方法,考察不同浓缩、干燥工艺对于补脾益肾方化学成分的影响。目的:1.采用超高效液相色谱与线性离子阱-静电轨道阱傅里叶高分辨质谱组合质谱仪(HPLC-LTQ-Orbitrap-MSn)分别阐明黄芪、三七单味药的化学成分组成,并对黄芪黄酮类、黄芪皂苷类、三七皂苷类等不同化学类型结构进行质谱裂解规律研究。2.建立HPLC-LTQ-Orbitrap-MSn分析法,全面反映及阐明黄芪三七药对的化学组成,对主要化学成分峰进行准确归属、识别,初步建立基于组合质谱技术的黄芪三七指纹图谱。3.建立HPLC-MS测定6种异黄酮类及8种皂苷类成分的方法,考察黄芪-三七药对配伍前后及不同配比条件下,黄酮类及皂苷类成分的溶出变化情况,从有效成分层面探讨黄芪-三七药对配伍对药效物质的动态变化过程,即配伍规律对药效物质动态影响。4.采用HPLC-LTQ-Orbitrap-MSn分析方法,全面快速地阐明补脾益肾方的化学组成,并对黄芪、党参、制何首乌、丹参等主要药味的不同化学类型结构进行质谱裂解规律研究。5.克服药效物质定量研究测定成分单一等问题,建立HPLC-MS测定7种代表性化学成分的定量检测方法,考察不同浓缩、干燥工艺对于补脾益肾方化学成分的影响。方法:1.采用HPLC-LTQ-Orbitrap-MSn法正、负两种离子扫描模式分别对黄芪、三七供试品溶液进行扫描,色谱柱为菲罗门kinetex色谱柱(100mmX2.1mmID,1.7 μm),流动相为乙腈(B)和0.1%甲酸水(A)梯度洗脱,流速为300μ ·min-1。样品先采用FT进行全扫描,二级和三级质谱采用动态数据依赖性扫描,选取上一级最高峰进行CID碎片扫描。2.建立HPLC-LTQ-Orbitrap-MSn分析方法,测定质谱条件同上,建立黄芪-三七药对成分指纹图谱测定方法,参考单味药实验数据、文献资料及对照品对照法鉴别指认色谱峰,对组方质谱图中主要成分峰进行快速鉴别。3.建立HPLC-MS法测定6种异黄酮类及8种皂苷类成分,采用ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1 ×50 mm 1.8μm),流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液,流速:250.0μL·min-1。选用多反应离子检测模式,目标母子离子对定量检测。测定黄芪-三七不同配比化学成分溶出量,通过3:0、3:0.5、3:1及3:2配伍组考察配伍对黄芪成分溶出量的影响;通过0:1、1.5:1,3:1及6:1配伍组考察配伍对三七成分溶出量的影响。4.采用HPLC-LTQ-Orbitrap-MSn正、负两种离子扫描模式分别对补脾益肾方供试品溶液进行扫描,色谱柱为菲罗门kinetex色谱柱(100mmX2.1mmID,1.7μm),流动相为乙腈和0.1%甲酸水梯度洗脱,流速为200μL·min-1。样品先采用FT进行全扫描,二级和三级质谱采用动态数据依赖性扫描,选取上一级最高峰进行CID碎片扫描。同时比较配伍前后,主要化学成分峰的相对峰面积,考察组方配伍对化学成分溶出的影响。5.建立HPLC-MS法测定补脾益肾方中毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、二苯乙烯苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸A及丹酚酸B等7种主要化学成分含量,采用ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1×50 mm 1.8μm),流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液,流速为250.0 μl·mi-1,选用选择离子检测模式,目标母子离子对定量检测。测定并比较补脾益肾方在不同浓缩及干燥工艺条件下的化学成分含量。成果:1.分别通过建立黄芪、三七中化学成分质谱数据处理策略,对化学成分进行快速鉴定。通过比对化合物精确质量数、多级质谱碎片离子、参考对照品质谱裂解规律,共鉴定黄芪中黄酮类成分48种,其中异黄酮类18种,紫檀烷类10种,异黄烷类8种,黄酮类7种,二氢异黄酮类5种;共鉴定黄芪中皂苷类成分31种,其中包括黄芪皂苷类及大豆皂苷类;共鉴定三七中皂苷类成分49种。2.比较黄芪-三七药对获取的质谱信息与单味药的精确相对分子量信息和多级质谱碎裂信息,对组方质谱图中39个不同类型化学成分进行了快速鉴别。根据HR-MS得到的精确分子量信息及CID碎片扫描给予的质谱特征碎裂信息,确定了黄酮类及皂苷类各化合物峰的归属。并通过部分对照品保留时间和质谱行为的比较,为化合物的归属提供了佐证。3.黄芪三七药对不同的配比分别对黄芪、三七中的主要成分的溶出含量变化产生一定的影响。与黄芪水提液相比,黄芪-三七配伍后,随着三七的配伍量增大,水提液中6种黄芪异黄酮类及3种黄芪皂苷类成分的含量先随之升高再降低;与三七水提液相比,黄芪-三七配伍后三七化学成分溶出量升高,但随着黄芪配伍量的增加,三七化学成分人参皂苷Rg1、Rd和Rb1逐步降低。4.补脾益肾方中,化合物在负离子模式下响应更佳,因此采用负离子为主要检测分析模式,对大多数化合物进行了初步的结构确证。补脾益肾方LC-MS图中主要含有80个主要色谱峰,且各主要色谱峰之间实现较好的分离。通过检测得到的各化学成分峰的保留时间和精确分子量,并结合多级质谱裂解碎片信息及与对照品、数据库及相关文献数据比对进行化学成分确认。相对峰面积比较表明,补脾益肾组方配伍煎煮前后化学成分含量发生一定变化,主要体现在黄芪异黄酮类及皂苷类成分含量略有升高,丹酚酸类成分含量略有下降。5.不同浓缩及干燥工艺条件对补脾益肾方中主要化学成分的含量变化产生一定的影响。补脾益肾方干燥品中,其中冷冻干燥及喷雾干燥主要成分的含量损失较小。喷雾干燥,冷冻干燥后各主要成分的含量均较高且比较稳定,故喷雾干燥法缩短了干燥时间,降低了有效成分的损失,其工艺条件较合理。结论:本课题分别选取含有黄芪药味的药对及复方,即黄芪-三七药对以及补脾益肾方,采用UPLC/ESI-LTQ-Orbitrap MSn组合质谱技术,分别对组方进行化学成分鉴定及质谱裂解规律研究,探讨复方的药效物质基础。此外,对两种组方开展多成分定量分析,分别探讨配伍比例、浓缩干燥工艺影响药效物质的动态过程。针对中药物质基础研究中化学成分鉴定的难点问题,论文采用液相色谱质谱联用技术,探索性的研究了中药黄芪、三七、党参、制何首乌、丹参和菟丝子中的多种化学成分。研究归纳了包括黄芪异黄酮类、黄芪皂苷类、三七皂苷类、苯丙苷类、党参炔苷类、二苯乙烯苷类、蒽醌类等多种结构类型的的天然产物的裂解规律,并推导了这些化合物的特征性碎片离子及质谱裂解途径。结果显示了 UPLC/ESI-LTQ-Orbitrap MSn组合质谱技术在中药复杂体系中的良好应用前景。针对中药复方中化学成分复杂,含量差异大等特点,采用基于LC-MS技术进行多成分定量的方法,考察了黄芪-三七药对配伍前后及不同配比条件下,黄酮类及皂苷类成分的溶出率变化情况。结果表明药对不同配伍比例对各主要组分溶出,包括黄芪异黄酮类、黄芪皂苷类及三七皂苷类的溶出有一定的影响。同时,通过建立HPLC-MS测定化学成分的定量检测方法,考察了不同浓缩、干燥工艺对于补脾益肾方化学成分的影响,表明减压浓缩及喷雾干燥工艺是比较合理的工艺条件,对于化学成分的损失较小。