论文部分内容阅读
【目的】1.比较Ph+ALL、Ph+MPAL和Ph+AML这三类具有相同遗传学背景但免疫表型截然不同的三组疾病临床和实验室特征的异同点和治疗疗效,以及酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)和异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的临床应用价值。2.比较Ph+ALL、Ph+MPAL和Ph+AML基因表达谱、基因组拷贝数变异和基因突变的特点及临床意义。3.初步阐述RUNX1突变在费城染色体阳性急性白血病中的作用和机制。【方法】1.系统性收集2009.01~2018.06我中心诊治的费城染色体阳性急性白血病患者的临床、细胞遗传学和分子生物学等相关资料,对所有患者进行随访,比较Ph+ALL、Ph+MPAL和Ph+AML患者的临床和实验室特征,统计生存情况,探究TKIs、allo-HSCT对于治疗疗效和生存的影响。2.对76例费城染色体阳性急性白血病患者进行定制捕获二代测序分析其单个基因框移突变和点突变异常,对50例患者采用比较基因组杂交技术分析基因组大片段缺失或扩增异常,对28例患者进行基因表达谱差异性分析,结合基因组学和转录组学技术明确Ph+ALL、Ph+MPAL和Ph+AML各自的特征。3.首先通过蛋白结构分析筛选RUNX1基因潜在功能位点,构建突变体质粒,分析各突变体的亚细胞定位,对G-CSF诱导的32D分化的影响,以及协同BCR-ABL1对人脐血CD34+细胞体外分化的作用,阐述RUNX1突变的下游基因改变。【结果】1.合计收集394例资料完善的病例:Ph+ALL 351例,Ph+MPAL 26例,Ph+AML 17例。三组患者初诊白细胞和血小板水平依次递增、骨髓原始细胞比例依次递减,Ph+ALL更常见单独t(9;22)和P190融合蛋白,Ph+MPAL和Ph+AML易见t(9;22)伴随附加染色体异常以及P210融合蛋白。TKIs的使用率和种类在三组中相似,Ph+ALL治疗诱导能获得93.5%的血液学缓解和34.5%的分子生物学缓解,Ph+MPAL血液学缓解率与Ph+ALL相似,为90.0%,但分子生物学缓解率仅为5.9%,Ph+AML难以获得理想的血液学缓解(68.8%),但三组总体生存和无事件生存无显著差异。205例(60.3%)Ph+ALL、12例(48.0%)Ph+MPAL和11例(64.7%)Ph+AML患者进行allo-HSCT,总体生存和无事件生存均得到显著改善,多因素分析中allo-HSCT具有最强的预后价值。TKIs可改善患者生存,使用达沙替尼进行诱导治疗的患者生存最优,2年总体生存率和无事件生存率为79%和72%。诱导治疗能否获得血液学缓解和分子生物学缓解均显著影响预后。2.Ph+ALL、Ph+MPAL和Ph+AML基因表达显著不同,Ph+ALL上调BCR-ABL1经典的下游信号通路,即PI3K-Akt和RAS信号通路基因表达,Ph+MPAL上调造血微环境相关因子表达,Ph+AML上调肿瘤相关转录因子、Wnt信号通路和细胞周期相关基因表达。Ph+ALL易见大片段基因扩增和缺失,B细胞发育相关的转录因子IKZF1、PAX5缺失见于22/37例(59%)和13/37例(35%)患者,突变分别见于3/50例(6%)以及4/50例(8%)患者,组蛋白甲基化相关基因SETD2、KMT2D突变见于9/50例(18%)和4/50例(8%)患者,与Ph-ALL相比罕见RAS信号转导通路相关基因突变。3/6例(50%)的Ph+AML患者表现为RUNX1突变,未有患者检出Ph-AML患者中突出存在的FLT3、NPM1和DNMT3A突变。11/20例(55%)Ph+MPAL患者检出RUNX1突变,其中6/8(75%)为双克隆,5/12例(42%)为双表型;3/7例(42.9%)检出IKZF1缺失,2/3例(67%)为双表型,1/4例(25%)为双克隆。3.通过蛋白结构预测分析,筛选并构建RUNX1-D171N、RUNX1-R177X、RUNX1-D305N、RUNX1-S287fs、RUNX1-V425fs突变体以及Vector和RUNX1-WT质粒,其中RUNX1-R177X和RUNX1-D305N除了在细胞核中表达以外,在细胞浆中也显著表达,其余突变体与RUNX1-WT相似,仅在细胞核中表达。单独的人源或鼠源G-CSF引起除RUNX1-R177X以外的32D细胞逐渐凋亡,联合低剂量IL-3引起RUNX1-R177X的32D细胞分化阻滞。无论是液体培养还是半固定培养,RUNX1-R177X协同BCR-ABL1均引起人脐血CD34+细胞髓系分化阻滞。在BCR-ABL1背景下,RUNX1突变进一步上调原癌基因CSF1R的表达,并通过CSF1R与其他造血微环境相关因子交互作用。【结论】1.Ph+ALL、Ph+MPAL和Ph+AML临床和实验室特征迥异,诱导治疗疗效Ph+ALL优于Ph+MPAL和Ph+AML,但生存情况无显著差异,均可从TKIs(尤其是达沙替尼)和allo-HSCT中获益。2.Ph+ALL、Ph+MPAL和Ph+AML患者具有显著不同的基因组学和转录组学特征;Ph+ALL以IKZF1、PAX5等B细胞相关转录因子异常为特征,常见SETD2、KMT2D等组蛋白甲基化基因突变,罕见RAS信号转导通路基因异常;Ph+AML以转录因子RUNX1突变为特征,少见FLT3、NPM1、DNMT3A突变;Ph+MPAL同时表现为IKZF1缺失和RUNX1突变,双表型Ph+MPAL更常见IKZF1缺失,双克隆Ph+MPAL更常见RUNX1突变。3.RUNX1突变主要位于RHD区域,导致RUNX1基因功能失;RUNX1突变后亚细胞定位发生改变;RUNX1-R177X突变阻滞G-CSF诱导的32D细胞分化;RUNX1-R177X突变协同BCR-ABL1抑制人CD34+细胞分化;RUNX1突变可能通过上调原癌基因CSF1R表达发挥作用。