【摘 要】
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2007~2008年,对新疆主要葡萄种植区的葡萄植原体黄化病发生情况进行了田间调查和采样。通过对采集的191个样品进行巣式PCR检测未发现样品中带葡萄黄化植原体。选用文献报道的
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2007~2008年,对新疆主要葡萄种植区的葡萄植原体黄化病发生情况进行了田间调查和采样。通过对采集的191个样品进行巣式PCR检测未发现样品中带葡萄黄化植原体。选用文献报道的两对引物(R16mF2/R16mR2、R16F2/R16R2)对葡萄金黄化植原体分别进行常规PCR和巢式PCR检测;并对两种方法的检测灵敏度进行了比较。结果表明:引物R16mF2/R16mR2检测的最小DNA模板量为20 ng/μL,以常规PCR产物为模板的巢式PCR选用两对引物大大增加了检测的可靠性,检测灵敏度提高了约10000倍;同时对PCR的反应条件优化,创建了最优的PCR反应条件;巢式PCR检测时间约为5 h。用植原体通用引物P1/P7扩增葡萄金黄化植原体基因组DNA,并克隆测序。得到的序列与GeneBank中其它植原体16S rRNA序列比对,利用DNASTAR软件构建了同源关系树,对供试菌株进行了分类与鉴定。根据葡萄金黄化植原体与其它植原体组16S rDNA序列差异,设计出对葡萄金黄化植原体具有稳定点突变的特异性引物FDF09/FDR09和TaqMan探针FDX-Probe;通过优化反应体系和反应条件,建立了针对葡萄金黄化植原体的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法;特异性试验结果显示:该检测方法特异性强,除葡萄金黄化植原体有荧光信号增强外,其它植原体和细菌材料均无荧光信号增强;该检测方法对FD-质粒DNA的检测灵敏度可达到0.56 fg/reaction;重复性试验结果显示该检测方法重复性高,稳定性好;检测时间约为1 h;并对采集的191个葡萄样品进行实时荧光PCR检测,未检出阳性材料;该引物对和探针已申报国家发明专利,专利申请号为:200910113240.1。
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