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猪霍乱沙门菌是造成仔猪副伤寒和人类食物中毒的重要人畜共患病病原。通过基因工程缺失致弱得到的沙门菌突变株不仅可以作为高效的弱毒疫苗,还可以进一步引入asd无抗性平衡致死系统将其开发为能携带多种外源保护性抗原的活疫苗载体。因此,筛选合适的减毒菌株构建高效活疫苗载体一直是疫苗学研究的热点之一。本试验首先运用自杀性质粒介导的两步法同源重组技术,在猪霍乱沙门菌单缺失株?crpC78-1的基础上先缺失cya基因,构建了毒力更弱且保留良好免疫原性的双缺失株?crp?cyaC78-1,然后再缺失asd基因将其开发为平衡致死系统。最后以此为载体携带PRRSV ORF5和ORF6融合基因,为开发预防仔猪副伤寒和PRRS的二联疫苗奠定基础。主要研究内容包括:1.猪霍乱沙门菌双缺失株?crp?cyaC78-1的筛选与鉴定以猪霍乱沙门菌单缺失株?crp C78-1为模板,扩增cya基因的上、下臂片段cya1和cya2,然后将二者克隆至中间转移载体pBluescriptSK(+),再将串联的cya1+cya2片段插入自杀性质粒p RE112,最后将重组自杀性质粒pRE?cya导入宿主大肠杆菌χ7213。以χ7213(pRE?cya)为供体菌,?crpC78-1为受体菌,运用自杀性质粒介导的两步法同源重组技术筛选猪霍乱沙门菌双缺失株?crp?cya C78-1。2.猪霍乱沙门菌双缺失株?crp?cyaC78-1的生物学特性检测对双缺失株?crp?cya C78-1的生化和生长特性、缺失基因的稳定性、对小鼠的毒力以及免疫保护等生物学特性进行检测,并将其与?crpC78-1、?cyaC78-1以及疫苗株C500进行比较。研究结果显示,?crp?cya C78-1利用碳源的能力与?cyaC78-1和?crpC78-1完全相同,保留了利用葡萄糖的能力,降低了利用半乳糖的能力,完全丧失了利用麦芽糖、鼠李糖、木糖等碳源的能力;其平均世代间隔为48.2min;其口服LD50是?crp C78-1的204倍,是疫苗株C500的322倍;用其口服免疫小鼠109CFU,能对野毒株10LD50CFU的攻击提供100%的保护。3.减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1平衡致死系统的的构建与鉴定以携带重组自杀性质粒pREΔasd的大肠杆菌χ7213为供体菌,减毒猪霍乱沙门菌双缺失株?crp?cyaC78-1为受体菌,利用自杀性质粒介导的两步法同源重组技术筛选?crp?cya?asd C78-1三缺失株。PCR及测序结果表明?crp?cya?asdC78-1三缺失株构建成功。进而本试验将含asd+基因的质粒pYA3493成功地电转入该三缺失株,构建了平衡致死系统?crp?cya?asdC78-1II(p YA3493),该菌株能够在不含DAP的普通培养基上正常生长。4.重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdC78-1(p YA-ORF5-ORF6)的构建与鉴定采用RT-PCR扩增PRRSV的ORF5和ORF6基因,并将其先后插入原核表达载体p YA3493,经PCR、酶切及测序鉴定正确之后,将重组载体p YA-ORF5-ORF6电转入减毒猪霍乱沙门菌三缺失株?crp?cya?asd C78-1。PCR及双酶切鉴定结果表明重组减毒猪霍乱沙门菌?crp?cya?asd C78-1(pYA-ORF5-ORF6)构建成功。将该重组菌在LB固体培养基中连续转接60代,每十代进行一次PCR鉴定,均能扩增出预期的目的条带,表明ORF5-ORF6融合基因能稳定遗传于该重组菌。