病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)是植物抵抗病毒侵染的一种自然机制,属于转录后水平的基因沉默现象。是目前开发的一种反向遗传学新技术,在动植物功能基因组学研究方面得到广泛应用。类黄酮化合物(Flavonids)是植物重要的次生代谢产物之一,在植物界中分布广泛且具有较强的生物活性,不仅有益人类身体健康还影响植物花器官发育和果实着色等。草莓(Fragaria×ananassa. Duch.)属蔷薇科草莓属多年生草本植物,其果实含高浓度的类黄酮化合物,具有重要的保健功能和显著的经济效益,因此倍受消费者和种植者的喜爱。目前,草莓类黄酮化合物代谢途径中主要结构基因已被认知,但是该途径的转录调控信息却知之甚少。大量研究表明,类黄酮化合物花青素苷、原花青素等代谢途径均受MYB转录因子调控。因此利用VIGS技术快速鉴定黄酮化合物代谢相关转录因子的功能,揭示在转录水平上对草莓黄酮类物质代谢途径的调控机理,对改善草莓的品质,以及其他园艺作物的遗传改良,具有重要的理论和实际意义。本研究以草莓‘丰香’(Fragaria× ananassa cv. Toyonaka)为材料。利用VIGS技术对草莓果实中类黄酮化合物代谢相关转录因子FaMYB5基因进行沉默,并对该基因沉默后类黄酮化合物途径相关基因表达量进行分析,同时对沉默后果实中花青素苷和原花青素的含量进行测定,以期全面探明草莓中FaMYB5基因对类黄酮化合物代谢途径的调控作用及其机制,揭示其功能。主要得到以下研究结果：1采用改良的CTAB法提取草莓不同组织及果实不同发育时期的总RNA,并反转录成cDNA。根据GenBank中已登录的森林草莓MYB5基因序列(JQ989280.1),同源克隆FaMYB5基因全长编码序列(Full Coding Sequences, CDS);序列分析表明：该基因CDS区共832bp,编码273个氨基酸,与森林草莓的MYB5同源性达97%。其蛋白结构中缺少R2结构域,因此FaMYB5转录因子更类似R3类MYB转录因子,并且其R3重复单元中存在与bHLH因子互作作用相关的[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R序列。2采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测FaMYB5在果实不同发育时期的基因表达情况。研究结果表明：FaMYB5基因在草莓果实发育的6个时期均有表达,其表达量存在差异。从整体趋势看,随着果实发育成熟,FaMYB5基因的表达是逐渐上升的。在果实的小绿期(SG), FaMYB5基因的表达量最低。但是在白果期(Vhite)出现一个降低的峰值,其表达量略高于小绿期,之后草莓果实开始转红时其表达量又逐渐上升,在果实全红期(FR)达到最大,说明FaMYB5与类黄酮化合物代谢有关。3构建VIGS载体pTRV-FaMYB5,通过注射法侵染草莓果实,导致果实内源FaMYB5基因沉默建立草莓VIGS体系。观察FaMYB5沉默后‘丰香’草莓果实的表观变化,采用半定量RT-PCR和qRT-PCR的方法检测FaMYB5基因的沉默效率,结果显示FaMYBS基因沉默效率达60%,成功构建了pTRV2-FaMYB5的VIGS重组载体及草莓VIGS体系。4采用半定量RT-PCR和qRT-PCR测定FaMYB5沉默后草莓类黄酮化合物代谢途径相关基因的表达量,同时分别采用HPLC和DMACA化学反应法对FaMYB5沉默后果实中的花青素苷和原花青素进行测定。结果表明：该基因沉默后,FaANS的表达量及花青素苷含量降低,而FaLAR、FaANR和FaMYB9表达量均增加,从而导致果实中原花青素含量增加。综合分析表明：FaMYB5是通过与FaMYB9转录因子竞争bHLH3蛋白结合的结合位点,从而抑制TTGI-FaMYB9-bHLH3三元复合体的活性,间接调控FaLAR/FaANR基因的表达。从分子和生理两方面的研究表明：FaMYB5转录因子是草莓类黄酮化合物代谢途径中的原花青素合成途径中的负调控因子。5研究发现FaMYB5基因沉默后FabHLH3、bHLH3△基因的表达量减少,说明它们之间存在抑制关系。Burr认为由于FabHLH3△和FaMYB5有相互作用,两者是否相互抑制还需进一步研究。另外FaMYB5基因沉默也引起了FaGL3基因表达量的增加,但aANS的表达量却下降,这与Jan G. Schaart推断的FaGL3转录因子可能促进FaANS的表达截然不同,所以FaGL3是否与FaTTG1和FaMYB 10结合形成MBW三元复合体,形成的三元符合体是否调节FaANS还需要进一步研究。