目的：小细胞肺癌（small cell lung cancer,　SCLC）是支气管肺癌中较为特殊的一种类型，恶性程度在所有肺癌中最高，预后极差。虽然SCLC对化疗敏感，但很快即可发生多药耐药（multidrug resistance, MDR）现象，导致化疗失败。MDR指肿瘤一旦对某种化疗药物产生耐药性，就同时对其他结构上无关、作用机理各异的药物也产生交叉耐药性，是一种特殊的广谱耐药现象。足叶乙甙（etoposide, VP-16）是半合成的鬼臼毒素衍生物，属于拓扑异构酶II（topoisomerase II, Topo II）毒性抑制剂，主要通过稳定Topo II-DNA断裂复合体，抑制DNA的再连接，造成DNA断裂损伤。VP-16是SCLC化疗的常用药物，单药有效率达40%，MDR现象是其化疗失败的重要因素之一。耐药细胞株的建立是探讨恶性肿瘤MDR现象的机制及其逆转研究的基础。以往研究中建立耐药细胞株多采用药物低浓度加量持续诱导法，这与临床短疗程、大剂量、反复用药的方式不一致。本研究模拟临床用药特点，采用高浓度反复间歇诱导的方法，建立SCLC的VP-16多药耐药细胞系H446/VP，并对其光镜形态、超微结构、及生长特点进行了研究；使用流式细胞术（flow cytometry, FCM）对细胞周期分布的变化进行了分析；采用MTT法分析了其耐药谱，深入探讨了它的生物学特性。小细胞肺癌系H446来源于美国国立肿瘤研究所，于1982年建系至今已有20余年，遗传背景清楚，生物学性状稳定。经检索国内、外文献，未见有H446细胞VP-16耐药亚系建立的报道。目前用于研究SCLC耐药相关研究的理想模型较少，因此，H446/VP的建立对今后从细胞和分子水平研究SCLC多药耐药机制具有较大的实用价值，也为体外筛选化疗药物，研究耐药逆转等提供了必要的实验材料。肿瘤的耐药机制非常复杂，常常有不止一种因素作用其中，现已认识到肿瘤耐药可能与以下因素有关：1. 具有药泵作用的膜蛋白的参与，如：<WP=5>P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）、肺耐药蛋白肺耐药蛋白（Lung resistance-related protein, LRP）等。2. 酶系统异常，如：拓扑异构酶、谷胺酰转肽酶等。3. 抗凋亡作用，如抗凋亡基因bcl-2、C-myc等过度表达。VP-16属Topo II抑制剂，所产生的耐药机制尤为复杂，常常发生Topo II的改变，主要由于药物作用后引起的Topo II含量或活性降低、基因变异、以及在细胞内分布的改变，以及它的两种同工酶Topo IIα和Topo IIβ的异常，但目前对此的研究较少。因此，有必要针对耐药细胞中Topo IIα和Topo IIβ表达进行深入探讨。本研究在建立MDR细胞系H446/VP的基础上，使用免疫细胞化学、原位杂交（in situ hybridization, ISH）、蛋白印迹（Western blotting）等先进方法检测H446/VP的Topo IIα、Topo IIβ、P-gp、LRP等基因与蛋白的表达，深入探讨H446/VP的耐药机制。随着人们对耐药机理的深入研究，越来越多的耐药逆转剂被开发出来。但或因副作用大，或因体内作用逆转效果不明显，或因价格昂贵等种种原因，迄今为止，人们尚未发现一种理想的耐药逆转剂。中药的资源丰富，至今已达一万余种，药理作用广泛，而且许多中药本身即有抗癌作用，提示在中药中筛选MDR逆转剂具有很大的优势。川芎嗪（Tetramethylpyrazinein, TMP）为中药川芎的有效成分之一，化学结构为四甲基吡嗪，属酰胺类生物碱，可人工合成，具有与维拉帕米同样的钙通道阻滞活性，是一种中药钙通道阻滞剂，主要用于心、脑血管疾病。最近已有研究观察到TMP对白血病等MDR肿瘤细胞具有耐药逆转作用，可能与其抑制P-gp的活性有关，但仍有诸多机制不明。因此，本研究应用MTT法、吖啶橙/嗅乙啶(acridine orange, AO/ ethidium bromide, EB)双荧光染色、流式细胞术、琼脂糖DNA电泳等方法观察了TMP单用或与VP-16合用对H446及H446/VP细胞的影响。材料与方法：1. 人小细胞肺癌多药耐药细胞系H446/VP的建立及其生物学性状 人小细胞肺癌细胞株H446细胞株购于中国协和医科大学细胞库。1.1细胞培养及耐药细胞株的诱导：将H446细胞用RPMI-1640培养液培养，内含10%小牛血清、青霉素100 U/ml链霉素100μg/ml，置37℃，5%CO2环境下培养。每日观察细胞生长情况。取对数生长期H446细胞与IC50浓度（47.78μg/ml）的VP-16在培养液内共同孵育，2小时后，弃含药培养液，用普通培养液继续培养，大部分细胞死亡，存活细胞缓慢<WP=6>生长，待存活细胞长满培养瓶后传代，进入对数生长期后，再次与此浓度的VP-16孵育，如此反复换液、传代，每4周检测其耐药性，直至产生耐药性，并且在无药培养液中耐药性保持稳定，整个过程持续7个月。 1.2 细胞生物学特性检测：1.2.1形态学检查：光镜检查：用倒置显微镜观察活细胞的形态结构；透射电镜检查：按常规方法制备超薄切片，经醋酸双氧铀和铅染液双染后，日立H-9000透射电镜下观察细胞超微结构。1.2.2生长曲线：绘制细胞生长曲线，计算倍增时间。按Patterson公式计算细胞在对数生长期的群体倍增时间。1.2.3克隆形成率的检测：克隆形成率（%）=克隆形成率/接种细胞数×100%。1.3 流式细胞术分析细胞周期：用FACSTARCalibur 型流式细胞仪(Becton Dickinson, CA, USA)测定。实验结果经计算机软件ModFit LT2.0处理，计