研究背景：肾脏间质纤维化(RIF)是各种原因引起的慢性肾脏疾病(CKD)发展到终末期肾病(ESRD)的共同病理途径,且疾病进程难以被逆转。RIF的主要病理表现包括肾间质炎症细胞浸润、细胞外基质(ECM)成分沉积、肾小管扩张以及小管上皮细胞坏死,最终导致大量细胞死亡、肾实质塌陷、肾小球滤过率下降、肾脏结构破坏和肾功能进行性衰竭。目前对RIF的早发现、早诊断、早治疗还很困难,临床上治疗RIF的措施主要集中在防止肾脏功能进一步恶化,但仍然无法彻底逆转肾间质纤维化的进程。所以,探讨RIF的发病机制并开发新型抗纤维化药物成为当前最迫切的任务。由浸润的炎症细胞引起的炎症反应和组织自由基损伤被认为是RIF的始动因素。目前的研究发现,浸润的炎症细胞主要通过以下三条途径造成肾脏损伤：(1)由炎症细胞分泌的炎症因子,例如白细胞介素(IL-1D)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、干扰素(γ-IFN)等,直接诱发肾小管上皮细胞凋亡,与此同时,炎症细胞产生的氧自由基能引起氧化应激反应,损伤肾脏组织；(2)炎症细胞还能分泌趋化因子,例如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),招募循环系统中的单核巨噬细胞和淋巴细胞到达受损部位,使炎症反应信号进一步放大,造成肾脏持续衰竭的恶性循环。(3)由浸润的炎症细胞分泌的促纤维化因子,如转化生长因子(TGF-β1),能诱导肾小管上皮细胞启动上皮间质转分化(EMT)生成肌成纤维细胞(MyoF),造成肾脏结构损坏、肾实质塌陷以及肾小球滤过率下降。大量研究认为,对肾小管上皮细胞转分化的研究是探讨RIF发病机制、开发抗纤维化的药物的基础。EMT指肾小管上皮细胞丢失上皮细胞标志物,并获得间质细胞标志物和迁移侵袭能力。通过EMT表型改变生成的MyoF能合成并分泌ECM成分,而大量ECM成分沉积在小管问质得不到分解,最终形成RIF。作为趋化因子,MCP-1不仅能招募并活化巨噬细胞,还能利用自身化学引诱物的特性,在TGF-β1的诱导下直接驱动细胞外基质沉积。因此,MCP-1在小管间质炎症进程中起关键的调节作用。然而,TGF-β1刺激细胞后,通过何种信号通路诱导MCP-1表达,并诱发EMT进程,目前还未完全阐明。在多种类型的肾脏细胞中,活化的转录因子NF-κB参与了MCP-1基因的转录和表达。此外,细胞外信号调节激酶(ERK1/2)作为一种促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK),在TGF-β1诱发EMT进程中扮演了重要角色。如何在EMT发生阶段,用药物干预以控制其发展,是治疗肾小管间质纤维化形成的关键。本实验主要通过体内实验和体外实验两部分,探讨MCP-1与EMT进程间的关系,并探讨ROS/ERK/NF-κB信号通路是否参与介导TGF-β1诱发EMT进程和RIF产生。牛蒡子是菊科牛蒡属两年生植物牛蒡(Arctium lappa L.)的成熟干燥果实,现代药理学研究表明,中药牛蒡子中主要药理成分牛蒡子苷元(ATG)具有良好的抗炎和抗氧化活性。本实验拟用大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型和TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞,观察ATG对ROS/ERK/NF-κB信号通路以及MCP-1蛋白表达的影响,并探讨RIF的发病机制,为治疗RIF寻找新的靶点乃至新的防治药物提供理论依据。目的：探讨ATG体外抑制MCP-1的生成,进而逆转肾脏间质纤维化进程中EMT进程的分子机制,同时,还探讨了ATG在体、内外逆转肾小管上皮细胞EMT表型改变,干预肾RIF的可能性,为预防和治疗肾脏纤维化形成寻找新的靶点乃至新的防治药物提供理论依据。方法：(1)建立大鼠UUO肾间质纤维化模型,观察ATG对大鼠肾间质纤维化进程中肾脏组织结构与功能的影响,并探讨ATG抑制间质纤维化的程度,是否与其降低肾间质组织中炎症反应和氧化应激水平有关。进一步观察ATG对大鼠间质纤维化模型中肾小管上皮细胞EMT进程的影响,为ATG在慢性肾间质纤维化防治中的应用提供理论依据。(2)采用TGF-β1模拟肾小管上皮细胞中的间质转分化信号,观察在不同浓度或不同处理时间情况下,TGF-β1对胞内活性氧(ROS)水平、ERK 1/2磷酸化水平、转录因子NF-kB活化水平、炎症趋化因子MCP-1的蛋白表达水平,EMT标志蛋白的变化情况,以期揭示在TGF-β1诱导下,肾小管上皮细胞内ROS、ERK1/2信号和核因子-κB活性对MCP-1大量生成并启动小管上皮细胞EMT表型改变的规律。(3)通过体外实验,探讨ATG是否具有抑制肾小管上皮细胞MCP-1蛋白表达上调,以及逆转EMT进程的能力,并进一步揭示ATG通过抑制ROS/ERK1/2/NF-κB信号转导过程,从而抑制MCP-1的生成,进而发挥其抑制和逆转EMT的作用机制。结果：(1)UUO大鼠纤维化模型证实,ATG可以通过抑制NF-κB介导的促炎症细胞因子MCP-1、IFN-γ、IL-β1和TNF-β1α mRNA表达水平,提高抗氧化酶SOD2蛋白表达水平和活性,抑制EMT发生的作用机制,延缓肾脏RIF进程。(2)体外实验证实,TGF-β1通过上调NADPH氧化酶-2,4及其胞内调控亚基表达,增加细胞内活性氧(ROS)生成水平,生成的ROS可能在胞内转化为H202介导信号,激活胞内ERK1/2 MAPK磷酸化,诱导NF-κB激活并入核启动MCP-1基因的转录与表达。同时,在TGF-β1诱导下,过表达MCP-1蛋白可进一步恶化肾小管上皮细胞EMT表型改变。(3)ATG可能通过抑制肾小管上皮细胞中ROS生成的关键酶源NADPH氧化酶家族成员的表达,抑制由ROS介导ERK1/2 MAPK/NF-κB信号通路,最终下调MCP-1的表达,从而逆转EMT表型改变。结论：在RIF过程中,MCP-1蛋白表达的异常上调可能参与了EMT进程,ATG可能通过作用于介导MCP-1表达的信号转导过程,从而降调MCP-1表达,抑制EMT发生,延缓肾脏TIF的进程。