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研究背景:双参颗粒是由花宝金教授根据肺瘤平膏以及多年临床实践研发的方剂,由西洋参、三七、冬虫夏草三种名贵中药组成,临床上多用于肺癌术后患者,以降低肺癌复发转移。那么双参颗粒是否能够预防肺癌的发生,仍需要寻找合适的动物模型进行科学研究。Dr.Yinling Hu教授在全世界首次报道自发性肺鳞癌小鼠模型。该模型小鼠以IKKα激酶失活敲入引起自发性肺鳞癌,通常需要4-6个月成瘤。该模型小鼠较好地模拟人肺鳞癌的标志物,可在局部肺组织形成炎症微环境,原癌基因激活,大量炎症细胞和炎症因子浸润,NF-κB等信号通路激活,多种生长因子表达增高,这样就能为中医药的长期干预提供较为理想的动物模型。在前期研究中,刘瑞博士在Dr.Yinling Hu实验室使用该模型小鼠观察双参颗粒的作用以及机制,发现干预5个月后,可有效改善模型小鼠皮肤溃烂情况,降低肺组织巨噬细胞比例,提高中性粒细胞比例,提示双参颗粒具有一定的预防作用。考虑到冬虫夏草资源不足以及价格昂贵,本实验减去冬虫夏草,保留西洋参和三七,试探性观察减味双参颗粒干预该模型小鼠在肺鳞癌成瘤率、皮肤溃疡表型是否也有一定作用,并且检测局部炎症微环境中的多种炎症细胞、NF-κB信号通路、相关基因表达、外周血炎症因子等方面来探究可能的机制。研究目的:观察减味双参颗粒预防自发性肺鳞癌小鼠的疗效和机制。研究方法:24只模型小鼠(KAKA)随机分为模型组(KAKA组)和减味双参颗粒组(KAKA+XS组),每组12只,5只野生型小鼠作为空白对照组(WT组),在小鼠断奶后,WT组和KAKA组小鼠正常进食普通饲料,KAKA+XS组小鼠进食含有0.788mg/g/d的减味双参颗粒的普通饲料。在各组干预5个月后,观察小鼠精神状态、皮肤毛发情况、小鼠体重、肺湿重、肺系数、脾湿重、脾系数等情况;肺鳞癌发生率;HE染色观察其他器官的炎症情况;使用流式细胞术检测肺、脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞的比例;使用流式免疫微球法检测外周血血清 IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α 和 IFN-γ 的表达情况;使用 Western Blot检测肺组织IKKα、p-IκBα、IκBα、COX-2、VEGF蛋白的表达情况;使用RT-qPCR检测 CHUK、Trim29、CDK1、IGF1 mRNA 的表达情况。研究结果:1.小鼠精神状态和皮肤毛发情况:在各组干预5个月后,WT组小鼠精神状态良好,KAKA组和KAKA+XS组小鼠均出现眼睑红肿、精神状态欠佳等情况,但KAKA+XS组小鼠精神状态略好。WT组小鼠毛发顺滑有光泽,KAKA组小鼠最早在9周龄时出现毛发粗糙无光泽,颈背部皮肤出现溃疡,KAKA+XS组小鼠最早在10周龄时也出现毛发粗糙无光泽,颈背部皮肤出现溃疡,但相比KAKA组小鼠,溃疡面积明显减小,并且出现皮肤溃疡表型的时间晚于KAKA组小鼠,两组差异有统计学意义(P<0.05)。2.小鼠体重、肺湿重、肺系数、脾湿重、脾系数:在各组干预5个月后,(1)与WT组相比,KAKA组小鼠体重减轻,差异有统计学意义(P<0.05);KAKA+XS组与KAKA组小鼠体重无统计学差异(P>0.05)。(2)与WT组相比,KAKA组小鼠在肺湿重、肺系数、脾湿重、脾系数方面均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与KAKA组相比,KAKA+XS组小鼠在肺湿重、肺系数、脾湿重、脾系数方面均无统计学差异(P>0.05)。3.小鼠肺鳞癌成瘤率:在各组干预5个月后,KAKA组有4只小鼠出现自发性肺鳞癌(4/8),KAKA+XS组没有小鼠出现自发性肺鳞癌(0/9),两组相比,有统计学差异(P<0.05)。4.小鼠各器官HE染色情况:在各组干预5个月后,(1)WT组肺组织无明显充血水肿和炎症细胞浸润,KAKA组可见肺泡结构受到破坏,充血水肿,有大量炎症细胞浸润,有肺鳞癌标志性“角化珠”形成,细胞呈异型性,KAKA+XS组也可见肺泡结构受到破坏,充血水肿,有炎症细胞浸润,与KAKA组相比,肺组织炎症程度无明显减轻。(2)WT组为正常皮肤组织HE染色,KAKA组和KAKA+XS组均可见表皮的角质层明显增厚,棘皮层增厚、细胞水肿,可见大量淋巴细胞浸润,真皮乳头层可见大量淋巴细胞浸润,但KAKA+XS组炎症程度明显减轻。(3)WT组可见中央静脉,肝小叶结构完整,汇管区可见小叶间静脉、动脉、胆管等结构,KAKA组和KAKA+XS组均可见汇管区、中央静脉附近纤维组织增生,淋巴细胞浸润,两组未见明显差异。(4)WT组为正常肾组织HE染色,KAKA组和KAKA+XS组均可见肾小球毛细血管充血,肾间质充血,两组比较无明显差异。(5)WT组为正常胰腺HE染色,KAKA组和KAKA+XS组均可见胰腺腺泡组织不同程度萎缩,间质弥漫性纤维组织增生,可见大量淋巴细胞浸润,但KAKA+XS组比KAKA组炎症程度明显减轻。5.减味双参颗粒对肺组织炎症细胞的影响:在各组干预5个月后,(1)WT组和KAKA组小鼠肺组织中CD4+T、CD8+T细胞比例无统计学差异(P>0.05);与KAKA组相比,KAKA+XS组小鼠肺组织CD4+T、CD8+T细胞比例提高,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)与WT组相比,KAKA组小鼠肺组织NK细胞比例提高,差异有统计学意义(P<0.05);与KAKA组相比,KAKA+XS组小鼠肺组织NK细胞比例提高,有统计学差异(P<0.05)。(3)与WT组相比,KAKA组小鼠肺组织中性粒细胞比例明显提高,差异有统计学意义(P<0.05);KAKA+XS组与KAKA组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。(4)与WT组相比,KAKA组小鼠肺组织巨噬细胞比例明显提高,差异有统计学意义(P<0.05);与KAKA组相比,KAKA+XS组比例降低,差异有统计学意义(P<0.05)。6.减味双参颗粒对脾脏炎症细胞的影响:在各组干预5个月后,(1)与WT组相比,KAKA组小鼠脾脏中CD4+T和CD8+T细胞比例明显提高,有统计学差异(P<0.05),KAKA与KAKA+XS两组小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细胞比例,无统计学差异(P:>0.05)。(2)与WT组相比,KAKA组小鼠脾脏NK细胞比例提高,有统计学差异(P<0.05);与KAKA组相比,KAKA+XS组小鼠脾脏NK细胞比例提高,有统计学差异(P<0.05)。(4)WT和KAKA两组小鼠脾脏中性粒细胞和巨噬细胞比例,无统计学差异(P>0.05),KAKA与KAKA+XS两组小鼠脾脏中性粒细胞和巨噬细胞比例,无统计学差异(P>0.05)。7.减味双参颗粒对小鼠外周血炎症因子的影响:在各组干预5个月后,与WT组相比,KAKA组小鼠外周血血清IL-2、IL-6、IL-10表达水平均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),TNF-α和IFN-⒊表达水平均无明显统计学差异(P>0.05);与KAKA组相比,KAKA+XS组小鼠外周血血清IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α表达水平均无明显统计学差异(P>0.05),IFN-γ表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。8.减味双参颗粒对小鼠肺组织相关蛋白的影响:在各组干预5个月后,与KAKA组相比,KAKA+XS组小鼠肺组织IKK α表达增加,p-IκBα表达降低,IκBα表达增加,COX-2和VEGF的表达均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。9.减味双参颗粒对小鼠肺组织相关基因表达的影响:在各组干预5个月后,与WT组相比,KAKA组小鼠肺组织CHUK mRNA表达降低,Trim29、CDK1、IGF1 mRNA的表达均增加,差异均有统计学意义(P<0.05);与KAKA组相比,KAKA+XS组小鼠肺组织CHUK mRNA表达增加,Trim29、CDK1、IGF1 mRNA的表达均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。研究结论:1.减味双参颗粒可一定程度改善KAKA小鼠精神状态、皮肤毛发以及溃疡情况,延长皮肤表型出现的时间,降低自发性肺鳞癌的发生率,减轻皮肤、胰腺炎症。2.减味双参颗粒可能通过提高CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞,降低巨噬细胞的比例而降低自发性肺鳞癌的发生率。3.减味双参颗粒可能通过提高外周血血清IFN-γ的水平增强免疫细胞杀伤功能而降低自发性肺鳞癌的发生率。4.减味双参颗粒可能通过提高IKKα、IκBα、降低p-IκBα、COX-2、VEGF的蛋白水平抑制NF-κ B信号通路而发挥抗血管生成的作用。5.减味双参颗粒可能通过降低Trim29、CDK1、IGF1 mRNA的表达,抑制细胞过度增殖而抑制自发性肺鳞癌的发生。