背景勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)是中老年男性最常见的性功能障碍之一,是一个令人困扰的问题,且随着现在生活节奏和压力增大等因素的改变,ED的发病率逐年升高。ED被认为是一个良性疾病,但它与密切关系着人们的身心健康,而且对患者及其家人的生活质量均产生重大影响。据报道,约有52%的40-70岁男性患有ED,到2025年,预计全球大约有3.22亿男性存在不同程度的勃起功能障碍。最新流行病学研究发现,ED的发病率在小于40岁男性患者中为1%-10%,40-49岁为2%-9%、60-69岁为20%-40%,而在大于70岁的男人中则高达50-100%。虽然目前ED的治疗方法较多,但存在缺陷,比如疗程过长、疗效不确切、费用高昂、尤其是很大一部分ED患者对一线药物5型磷酸二酯酶抑制剂效果不明显而又不能或不愿意接受二线治疗(如真空勃起装置)和三线治疗(阴茎假体置入)方案等。因此,探索更理想合理的治疗方案是ED临床治疗的迫切需求。ED的发生、发展是一个多因素、多环节的复杂过程,其具体发病机制目前尚不十分明确。因而,明确ED的发病机理对寻找有效的预防和治疗措施具有重要的意义。阴茎海绵体由网格状海绵体小梁和小梁间隙所构成。海绵体小梁是由大量平滑肌细胞组成的,阴茎海绵体平滑肌细胞(corpus cavernosum smooth muscle cell, CCSMC)是阴茎海绵体主要的收缩与松弛组成成分,阴茎海绵体平滑肌为阴茎勃起过程中的终末组织,处于重要的核心地位。CCSMC是阴茎海绵体收缩与舒张的主要成分,在阴茎勃起的过程中发挥着至关重要的作用,它既是阴茎能够维持正常勃起的结构基础,也是神经、血管、内分泌等诸多因素作用的终末组织。所以当CCSMC的数量或者功能发生变化时,必将对阴茎的正常勃起产生重大的影响。有学者研究表明,糖尿病引起的CCSMC数量减少、细胞超微结构发生病理改变及细胞舒缩功能受损是导致ED发生的重要原因。我们也已证实糖尿病性ED大鼠的阴茎海绵体组织及细胞中,CCSM细胞数量减少及细胞舒缩功能受损；进一步研究发现平滑肌细胞(SMC, smooth muscle cells)标记物、收缩相关因子α肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)、平滑肌细胞肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain, SMMHC)、肌滑蛋白(smoothelin)、碱性调宁蛋白(calponin)表达明显下降。因此,ED的发生与CCSMC的病理改变和缺失密切相关,目前尚缺乏从根本上改善这些病理状态的理想方法。研究表明,CCSMC数量的变化与ED的严重程度关系非常密切。糖尿病ED大鼠中CCSMC凋亡增加,细胞外基质纤维化增加,海绵体小梁则失去了维持正常的收缩和舒张功能的基础,流入海绵窦内动脉血减少,致使阴茎勃起时海绵窦内压力不足以压迫阻断白膜下的静脉网,从而导致ED发生。细胞凋亡是在特定的内源和外源信号诱导下,机体内细胞的死亡程序被激活,并在相关基因的调控下发生的程序性死亡。随着分子生物学技术的发展和应用,我们对于细胞凋亡的过程有了更深刻的认识,但是迄今关于细胞凋亡的确切机制仍未完全阐明。细胞增殖是细胞分裂增加细胞数量的一个过程。细胞增殖是生物体重要的生命特征之一,也是机体维持细胞数量平衡和正常功能所需的必要条件。细胞的凋亡与增殖现象是互相联系和密不可分的,贯穿于我们生命活动的始终,维系机体内环境的动态平衡。平滑肌细胞与骨骼肌细胞及心肌细胞有所不同,平滑肌细胞的分化状态可以逆转,根据结构和功能的不同,可以将血管平滑肌分为收缩型和合成型两种。收缩型的主要功能是维持平滑肌的收缩和舒张,维持组织器官的正常形态结构和功能,而合成型主要在细胞增殖、分化、迁移、分泌及降解胞外蛋白等方面发挥作用,平滑肌细胞能根据细胞的局部环境或因子的刺激而重塑其表型,具有双向分化功能,因此,将平滑肌细胞在收缩型与合成型两种表型之间的转化称之为表型转化。动脉粥样硬化的早期,血管平滑肌细胞发生表型转化,细胞增殖很快,形成粥样斑块,而在晚期的时候,血管平滑肌细胞增殖明显下降,胞外胶原基质增生,出现平滑肌萎缩,伴有组织纤维化改变。阴茎海绵体被喻为血管的终末组织,是一种类似的血管组织,本课题组前期研究已经证实：早期糖尿病大鼠的CCSMC增殖速度明显快于正常对照组。经验证后证实CCSMC也存在收缩性和合成型两种表型并拥有表型转化的特性。我们也发现血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB)可促进CCSMC由收缩型向合成型转化。同时还发现糖尿病ED动物模型和高血压ED动物模型的CCSMC也发生了表型转化,从而推测CCSMC的表型转化与ED之间存在密切的关系。因此,研究CCSMC发的表型转化对了解ED的病因和治疗有重要临床意义。微小核糖核酸(microRNA, miRNA)为小分子非编码RNA,它的基因广泛存在于各个染色体中,这些miRNA只占人类基因总数的2%,但却调控着人类30%以上的基因表达,在细胞中发挥极其重要的调控作用,尤其是在肿瘤的发生发展、器官的发育以及细胞增殖和分化方面。研究发现,miR-145主要在血管平滑肌细胞中表达且它的表达与平滑肌细胞表型转化有关,是血管平滑肌的一个重要的表型调节剂。在血管损伤和动脉硬化时,miR-145的表达呈下降趋势,平滑肌细胞增殖分化加快；而恢复它的表达后可见到平滑肌细胞增殖被抑制,收缩和舒张功能增强,平滑肌细胞恢复了收缩型状态。较多研究发现miR-145在血管平滑肌细胞表型转化中起着重要作用,目前众多研究表明血管平滑肌细胞和CCSMC在生理功能上类似,但目前推测miR-145是否对其表型转化也存在调控作用尚不明确,课题组前期发现与正常大鼠相比,miR-145在糖尿病性ED大鼠中的表达量是明显减低的,且糖尿病性勃起功能障碍大鼠CCSMC也发生了表型转化,从而我们推测miR-145在CCSMC的表型转化中可能也起着重要的作用。但miRNA-145对CCSMC有何影响?miRNA-145的缺失或过表达对大鼠勃起功能的影响和具体的调控机制是如何的?我们目前并不清楚。目的本研究首先构建高效稳定的沉默及过表达miR-145慢病毒载体,然后通过细胞实验及动物实验了解miRNA-145对CCSMC表型转化的影响和可能的机制,为阐明勃起功能障碍的发病机制和提供治疗手段提供理论依据。方法1.miR-145沉默与过表达慢病毒载体的构建及鉴定a)构建miR-145沉默与过表达慢病毒载体b)原代培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞及鉴定c)病毒感染CCSMC后采用RT-PCR检测感染效率2.miR-145在体外对大鼠CCSMC的表型转化和增殖的影响1)MTS检测miR-145对细胞增殖的影响。2)流式细胞仪检测miR-145对细胞周期的影响。3)划痕实验检测miR-145对细胞迁移能力的影响。4)反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测miR-145对细胞表型标志物的影响。5)蛋白质印迹(Western blot, WB)检测miR-145对细胞表型标志物的影响。3.miR-145在体内对SD大鼠阴茎海绵体平滑肌表型转化和勃起功能的影响1)沉默miR-145对大鼠阴茎勃起功能的影响。2)免疫组化检测沉默miR-145对大鼠阴茎海绵体平滑肌表型标志物的表达情况3) RT-PCR检测沉默miR-145对大鼠阴茎海绵体平滑肌表型标志物mRNA表达的影响。4)WB检测沉默miR-145对大鼠阴茎海绵体平滑肌表型标志物蛋白表达的影响。结果1.miR-145沉默与过表达慢病毒载体的构建及鉴定1)成功构建miR-145沉默与过表达慢病毒载体2)成功分离、原代培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,显微镜下观察原代培养的细胞形态呈平滑肌细胞特征性生长,表现为梭形,呈谷-峰样生长。a-SMA免疫荧光鉴定：荧光显微镜下可见绿色荧光分布在胞核和胞浆中,阳性率达95%以上。3)RT-PCR结果显示：与正常对照组比较,anti-NC组细胞中miR-145的表达量降低了8%±3%,其差异无统计学意义；而anti-miR-145组细胞中miR-145的表达量降低了76%±5%,其差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组比较,miR-NC组细胞中miR-145的表达量升高1.52±0.5倍,其差异无统计学意义,miR-145组细胞中miR-145的表达量增加了135.5±9倍,其差异有统计学意义(P<0.05)。2.miR-145在体外对大鼠CCSMC的表型转化和增殖的影响1)MTS结果显示：anti-miR-145后细胞的增殖能力较空白对照组及anti-NC组增强,其差异具有统计学意义(P<0.05)。过表达miRNA-145后细胞的增殖能力较正常对照组和miR-NC组减弱,PDGF-BB组较正常对照组增殖能力增强,PDGF-BB+miR-145组细胞增殖能力较PDGF-BB组减弱,但较miR-145组增强,各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。2)流式细胞术检测结果显示：正常对照组Go/G1期细胞比例为90.3%±1.94%,anti-NC组G0/G1期比例为细胞89.5±2.16%,anti-miR-145组G0/G1期细胞比例为71.6%±3.28%,anti-NC组与正常对照组比较差异无统计学意义,anti-miR-145组与anti-NC组比较差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组S期细胞比例为6.2%±0.87%,anti-NC组S期细胞比例为7.3%±1.13%,anti-miR-145组S期细胞18.2%±1.16%,anti-NC组与正常对照组比较差异无统计学意义,anti-miR-145组与anti-NC组比较差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组G2/M期细胞比例为3.5%±0.75%,anti-NC组G2/M期细胞比例为3.2%±1.15%,anti-miR-145组G2/M期细胞比例为10.2%±3.15%,anti-NC组与正常对照组比较差异无统计学意义,anti-miR-145组与anti-NC组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3)划痕实验结果显示anti-miRNA-145后细胞的迁移能力较正常对照组及anti-NC组增强。miRNA-145组细胞的迁移能力较正常对照组及miR-NC组稍减弱,PDGF-BB组较正常对照组迁移能力增强,PDGF-BB+miR-145组细胞迁移能力较PDGF-BB组减弱,但较niRNA-145组增强。4) RT-PCR结果显示anti-miR-145组细胞α-SMA、SMMHC、Calponin的mRNA表达较anti-NC组减少,且差异具有统计学意义(P<0.05)。anti-NC组和正常对照组间差异无统计学意义。miRNA-145组细胞α-SMA、SMMHC、Calponin的mRNA表达较miR-NC组增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。PDGF-BB组细胞α-SMA、SMMHC、Calponin的]mRNA表达较正常对照组减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。PDGF-BB+miR-145组细胞α-SMA、SMMHC、Calponin的mRNA表达较PDGF-BB组增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。miR-NC组和正常对照组间差异无统计学意义。5) Western blot结果显示anti-miR-145细胞α-SMA、Calponin的蛋白表达较正常对照组及anti-NC组减少。miRNA-145组细胞α-SMA、Calponin的蛋白表达较miR-NC组增强,PDGF-BB组细胞α-SMA、Calponin的蛋白表达较正常对照组减弱,PDGF-BB+miR-145组细胞α-SMA、Calponin的蛋白表达较PDGF-BB组增强。3.miR-145在体内对SD大鼠阴茎海绵体平滑肌表型转化和勃起功能的影响。1)颈动脉压(mean arterial pressure, MAP)在假手术组(sham)、无关序列组(anti-NC)、培养基组(DMEM)、沉默miRNA-145组(anti-miR-145)间总体比较差异没有统计学意义(P>0.05)。 anti-miR-145组与Sham组、anti-NC组、DMEM组比较阴茎海绵体内压(Intracavernous pressure, ICP)减弱,差异均有统计学意义(P<0.05)。anti-miR-145组与Sham组、anti-NC组、DMEM组比较ICP/MAP减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。2)免疫组化结果显示anti-miR-145组阴茎海绵体组织的α-SMA、Calponin表达量较Sham组、anti-NC组、DMEM组减少。3) RT-PCR结果显示anti-miR-145组组织的α-SMA、SMMHC、Calponin的mRNA表达量较NC组减少,且差异具有统计学意义(P<0.05)。Sham组、anti-NC组、DMEM组各组间比较差异没有统计学意义。4) Western blot结果显示anti-miR-145组组织的α-SMA、SMMHC、Calponin的蛋白表达量较Sham组、anti-NC组、DMEM组减少。结论1、成功构建高效稳定表达的沉默及过表达miR-145慢病毒载体,为研究miR-145在CCSMC中的作用提供实验保障。2、miR-145可抑制CCSMC的增殖及迁移。3、miR-145可抑制CCSMC从收缩型向合成型转化,即抑制表型转化。4、沉默miR-145可致大鼠阴茎勃起功能降低,为进一步研究ED的病因及治疗提供依据。