目前,尚无文献报道F₁F_o-ATP合酶或其亚基参与白念珠菌（乃至于其他真菌）对宿主的感染过程。白念珠菌（乃至于其他致病性真菌）与人类的F₁F_o-ATP合酶结构具有特异性,极有可能作为抗真菌药物作用的新靶点。在此之前,首先需要明确F₁F_o-ATP合酶参与白念珠菌对宿主的感染过程及其作用机制。目的本研究率先采用同源重组方法构建白念珠菌F₁F_o-ATP合酶β亚基编码基因ATP2缺失株及其回复株;研究白念珠菌F₁F_o-ATP合酶β亚基是否参与小鼠致死性感染及其机制。方法第一部分:（1）采用SAT1-Flipper基因敲除策略构建白念珠菌F₁F_o-ATP合酶β亚基编码基因ATP2缺失株及其回复株,并以PCR和Southern blot验证ATP2缺失和SAT1筛选标记去除。（2）采用琼脂点板实验（Spot assay）测定ATP2缺失株生长情况。第二部分:通过经血液感染小鼠,测定菌体致病力（生存率、器官载菌量、病理学等）。第三部分:（1）采用体外生长曲线、体内生长实验测定菌体生长。（2）菌丝形成、黏附、生物膜形成实验测定菌体菌丝形成、黏附、生物膜形成能力。（3）体外菌体与巨噬细胞共培养,测定菌体存活率、巨噬细胞损伤情况。（4）Spot assay、Alcian blue-binding和数字基因表达谱（Digital Gene Expression,DGE）测序和数据分析分别测定菌体对细胞壁压力药物（含钙荧光白、刚果红、卡泊芬净）敏感性、表面甘露聚糖含量、细胞壁毒力因子相关基因转录组表达水平。第四部分:（1）采用生长曲线和Spot assay测定菌体在不同碳源培养基中生长;菌落计数法和细胞内ATP含量实验测定菌体在不同碳源培养基中细胞活性。（2）菌丝形成、侵袭实验测定菌体在不同碳源培养基中菌丝形成和侵袭能力。（3）Spot assay和Alcian blue-binding实验分别测定菌体对细胞壁压力药物（含钙荧光白、刚果红）敏感性和表面甘露聚糖含量。第五部分:（1）采用菌落计数法和细胞内ATP含量实验测定菌体细胞活性与ATP相关性。（2）线粒体膜电位（ΔΨm）、细胞内活性氧（ROS）水平实验测定菌体线粒体功能变化。（3）NAD/NADH比值实验测定菌体还原当量变化。（4）DGE测序和数据分析测定菌体碳源代谢和线粒体功能相关的基因转录组表达水平。结果第一部分:（1）PCR和Southern blot结果显示成功构建了白念珠菌F₁F_o-ATP合酶β亚基编码基因ATP2缺失株及其回复株,以及去除了SAT1筛选标记。（2）Spot assay结果显示ATP2缺失株生长良好,与亲本株相比无明显差异。第二部分:体内动物实验结果显示ATP2缺失株组小鼠第30天仍全部存活,而亲本株组小鼠于感染后第9天全部死亡（P<0.05）;ATP2缺失株组小鼠肝脾肾器官载菌量明显比亲本株低（P<0.05）;ATP2缺失株组小鼠肾脏形态正常,无组织损伤,无炎症细胞,而亲本株组有严重组织损伤,大量菌丝聚集和炎症细胞浸润;回复株与亲本株无明显差别。第三部分:（1）体外生长曲线和倍增时间结果分别显示ATP2缺失株比亲本株生长轻度缓慢以及倍增时间延长0.5 h,差异无统计学意义（P>0.05）,回复株与亲本株无差异;体内小鼠生存率曲线结果显示感染ATP2缺失株（1.0×10⁶ cells）后小鼠第30天仍全部存活,然而感染亲本株（1.0×10⁵ cells）后小鼠在第5天出现死亡以及第14天全部死亡（P<0.05）,回复株与亲本株无差异。（2）菌丝形成、黏附、生物膜形成实验结果显示ATP2缺失株比亲本株菌丝形成、黏附、生物膜形成能力和活性降低。（3）体外菌体与巨噬细胞共培养,ATP2缺失株比亲本株菌体存活率降低6倍,对巨噬细胞损伤率降低2.5倍（P<0.05）。（4）Spot assay结果显示ATP2缺失株比亲本株在含细胞壁压力药物培养基中生长无差异;Alcian blue-binding结果显示ATP2缺失株比亲本株表面甘露聚糖含量无差异;DGE测序和数据分析结果显示ATP2缺失株比亲本株细胞壁毒力因子相关基因转录组表达水平无明显差异（P>0.05）。第四部分:（1）生长曲线和菌落计数法结果显示亲本株在非发酵碳源中比葡萄糖生长缓慢、细胞活性降低（P<0.05）;ATP2缺失株在非发酵碳源中OD₆₀₀值基本不发生变化,与亲本株差异明显,以及细胞活性比亲本株降低（P<0.05）;回复株与亲本株无差异。（2）菌丝形成和侵袭实验结果显示亲本株在2%非发酵碳源比2%葡萄糖中出芽率、菌丝长度,侵袭能力降低（P<0.05）,但在2%非发酵碳源联合0.2%葡萄糖均比2%非发酵碳源、0.2%葡萄糖中菌丝形成和侵袭能力增强;ATP2缺失株比亲本株出芽率、菌丝长度,侵袭能力降低（P<0.05）;回复株与亲本株无差异。（3）Spot assay实验显示亲本株在含钙荧光白、刚果红的非发酵碳源中培养基中生长抑制;ATP2缺失株比亲本株在含钙荧光白的培养基中生长促进,刚果红的培养基中生长抑制;回复株与亲本株无明显差别。Alcian blue-binding实验显示ATP2缺失株比亲本株细胞表面甘露聚糖含量升高（P<0.05）;回复株与亲本株无明显差别。第五部分:（1）菌落计数法结果显示ATP2缺失株存活细胞数在葡萄糖中第1-5天比亲本株高,第6天开始降低;在非发酵碳源中急剧减少,第7天时为0;回复株与亲本株无差异。细胞内ATP含量测定结果显示ATP2缺失株细胞内ATP含量在葡萄糖中第1-3天比亲本株高,第4天开始降低;在非发酵碳源中急剧减少;回复株与亲本株无差异。（2）ΔΨm结果显示ATP2缺失株的ΔΨm均比亲本株明显降低（P<0.05）;回复株与亲本株无明显差异。细胞内ROS水平实验结果显示ATP2缺失株的细胞内ROS水平均与亲本株无明显差异（P>0.05）;回复株与亲本株无明显差异。（3）NAD/NADH比值结果ATP2缺失株的NAD/NADH比值比亲本株明显升高（P<0.05）;回复株与亲本株无明显差异。（4）DGE测序和数据分析结果显示替代碳源代谢和线粒体功能相关的基因转录组表达水平上调。结论本研究成功构建了白念珠菌F₁F_o-ATP合酶β亚基编码基因ATP2缺失株及其回复株;明确了白念珠菌F₁F_o-ATP合酶β亚基缺失后无法对小鼠造成致死性感染;并且筛选出菌体毒力降低和巨噬细胞相关因素在β亚基缺失后无法对小鼠造成致死性感染机制中起关键作用;明确了β亚基调节碳源代谢适应是维持菌体毒力和对抗吞噬细胞吞噬作用的基础;进一步提示F₁F_o-ATP合酶β亚基通过调节白念珠菌细胞内ATP含量调控碳源代谢适应。本研究的完成将为进一步筛选能够作用于该靶点的抗真菌药物提供科学基础。