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研究目的:1验证前期工作中从小细胞肺癌细胞系H446癌干细胞和分化细胞中筛选出的差异表达基因在基因水平和蛋白水平表达的存在。2证明目的基因IL-8对小细胞肺癌细胞系H446癌干细胞的影响。研究方法:1验证小细胞肺癌细胞系H446癌干细胞和分化细胞中差异表达的基因1.1 q RT-PCR验证筛选出的差异表达上调基因在m RNA水平表达的存在;1.2 Elisa验证上述m RNA水平存在差异的基因在蛋白水平表达的存在。2证明IL-8对小细胞肺癌细胞系H446癌干细胞干性的影响2.1利用RNA干扰技术沉默基因IL-8在H446肿瘤球中的表达,通过q RT-PCR实验和Elisa实验证实基因IL-8在肿瘤球中的表达抑制成功,然后通过肿瘤球形成实验和q RT-PCR实验分析IL-8干扰前后肿瘤球的成球率和干性基因的基因表达差异。2.2采用给予H446细胞人重组蛋白IL-8(rh-IL-8)的方法,通过肿瘤球形成实验、q RT-PCR实验及迁移实验,分析IL-8对于H446细胞的成球率、干性基因u PAR、CD44、SOX2和Nanog等的m RNA表达水平和迁移率的影响。2.3采用给予H446细胞人重组蛋白IL-8的方法,通过MTS实验计数存活细胞的百分含量,分析IL-8对H446细胞存活率的影响。2.4通过给予H446细胞IL-8受体抑制剂Reparixin,分析Reparixin对于H446细胞成球能力的影响。研究结果:1小细胞肺癌细胞系H446癌干细胞和分化细胞中差异表达的基因1.1对前期工作中全转录测序分析筛选出的5个差异表达上调基因(IL-8、IL-2、SAT1、SPINK6和IGFBP3)进行验证,q RT-PCR结果显示IL-8和IL-2在肿瘤球中的m RNA表达水平高于贴壁细胞(n=5,P<0.01),而SAT1、SPINK6和IGFBP3在两群细胞中的m RNA表达水平无显著性差异(n=5,P>0.05);1.2对上述m RNA表达水平存在差异的IL8和IL2进行蛋白水平的验证,Elisa结果显示IL-8在肿瘤球中的分泌量高于贴壁细胞(n=4,P<0.05),IL2在两群细胞中检测到的分泌量无显著性差异(n=4,P>0.05)。2 IL-8对小细胞肺癌细胞系H446癌干细胞干性的影响2.1 Si IL-8处理H446肿瘤球后的相关实验结果如下:q RT-PCR和Elisa实验结果显示经过30n M si IL-8处理后的肿瘤球中IL-8在m RNA水平和蛋白水平表达均得到显著抑制(n=5,p<0.001),提示IL-8在肿瘤球中的表达抑制成功;肿瘤球形成实验结果显示si IL-8干扰后的肿瘤球的成球率低于对照组(n=5,P<0.01);q RT-PCR实验结果显示通过si IL-8干预后的肿瘤球中的干性基因CD133、OCT4和Nanog的m RNA水平显著低于对照组(n=5,P<0.01),干性基因CD44的m RNA水平在两组中的表达无显著性差异(n=5,P>0.05)。2.2 rh-IL-8处理H446细胞后的相关实验结果如下:肿瘤球形成实验结果显示rh-IL-8处理后的H446细胞的成球率高于未处理组(n=5,P<0.001);q RT-PCR实验结果显示经过rh-IL-8处理后的H446细胞中的干性基因u PAR、CD44、SOX2和Nanog的m RNA表达水平高于未处理组(n=5,P<0.05),CD133、ABCG2和OCT4的m RNA表达水平在两组中无显著性差异(n=5,P>0.05);迁移实验结果显示5ng/ml和10ng/ml的rh-IL-8处理后的H446细胞的迁移率显著高于未处理组(n=5,P<0.001)。2.3 MTS实验结果显示rh-IL-8处理后的H446细胞的存活率高于未处理组(n=5,P<0.001)。2.4肿瘤球形成实验结果显示IL-8受体抑制剂Reparixin处理后的H446细胞的成球率显著低于对照组(n=5,P<0.05)。研究结论:1 IL-8在小细胞肺癌细胞系H446癌干细胞中的表达显著高于分化细胞。2 IL-8具有促进小细胞肺癌细胞系H446体外自我更新和干性基因表达的作用。3 IL-8具有促进小细胞肺癌细胞系H446体外细胞迁移和细胞增殖的能力。综上所述,IL-8可能具有促进小细胞肺癌细胞系H446癌干细胞干性的作用。因此,该研究可能为临床小细胞肺癌的耐药治疗提供理论依据。