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天冬氨酸激酶(Aspartokinase, AK)是天冬氨酸族氨基酸生物合成途径的限速酶,其受支路代谢产物的严格反馈抑制。为进一步提高AK催化活性,解除末端产物反馈抑制,以便构建高产氨基酸的工程菌株,本研究克隆了北京棒杆菌E31菌株的关键酶AK,以组氨酸标签蛋白形式在大肠杆菌中高效表达。通过定点饱和突变和高通量筛选方法获得高活力突变株,并进行野生型和突变体的酶学性质表征,为天冬氨酸族氨基酸基因工程菌的构建奠定了基础。结果如下：1、将北京棒杆菌C.pekinense E31中AK在大肠杆菌BL21(DE3)进行高效表达,分离纯化后得到分子量为48KDa的重组蛋白：该酶的最适反应条件是：26℃, pH8.0;26℃热稳定性检测显示,重组酶半衰期是4h；动力学试验结果显示AK是别构酶,参数so.5,nH和Vmax分别是4.42mM,3.49和91.99U/mg；大部分金属离子和有机溶剂对AK活性有抑制作用,而Mg2+,Zn2+和Ni2+在低离子浓度时对AK呈现激活效应,高离子浓度转变成抑制效应；AK受苏氨酸,赖氨酸和蛋氨酸的抑制,并受苏氨酸和赖氨酸协同反馈抑制。2、将生物信息学与分子生物学技术相结合,确定了4个相对保守的氨基酸突变位点,Gly(G)277、Met(M)354、Gly(G)359和Val(V)360,并构建饱和突变库；构建AK高通量筛选方法,通过筛选获得8个高活性的突变体酶,分别是G277E, G277K, M354L, M354I, G359K, G359F, V360F和V360N,并进行初步的酶学性质检测；在此基础上,对高活力突变体G359K和V360N进行详细酶学性质表征。3、8个突变体的初步酶学性质检测显示：突变体酶的最适反应温度在25-35℃之间,最适反应pH在7.5-9.0之间,多数为8.0-8.5；最适温度下热稳定性试验显示,突变体酶半衰期介于1.7-4h之间,明显低于野生型；突变体酶的Vmax提高了3.53-20.19倍。对突变体G359K和V360N的研究发现,低浓度Zn2+和Cu2+对WT的抑制作用转变为显著的激活作用；低浓度乙醇和二甲基亚砜对WT的抑制作用转化成明显的激活效应,低浓度正丁醇对突变体V360N也显示出显著的激活效应；突变体G359K依然受苏氨酸,赖氨酸和蛋氨酸的抑制,而低浓度Met, Thr+Lys, Thr+Met和Lys+Met对V360N呈现激活效应,特别是Lys+Met,高浓度时对V360N也显示出明显的激活效应。