目的利用组织芯片研究PinX1基因与肾癌转移及预后的关系;利用体外体内实验研究其在肾癌细胞转移过程中的具体分子机制。方法1.对本实验室已构建完成的具有完整临床资料和随访信息的两套独立的肾癌患者组织芯片(共353例)进行免疫组化染色,并对PinX1染色进行评分,研究PinX1与肾癌临床特征的相关性,探讨其与肾癌转移及预后的关系。利用Cox回归分析判断PinX1是否可作为独立预后因子判断肾癌患者的预后。2.利用PinX1 siRNA及pEGFP-C3-PinX1表达载体转染人肾癌786-O和ACHN细胞,Western Blot检测转染后两株肾癌细胞中PinX1蛋白表达情况,确定PinX1 siRNA及pEGFP-C3-PinX1表达载体的有效性。CCK-8细胞增殖实验检测PinX1基因低表达及高表达对两株肾癌细胞增殖能力的影响。细胞迁移、侵袭实验检测PinX1基因低表达及高表达对肾癌786-O和ACHN细胞迁移、侵袭能力的影响。Western Blot实验检测PinX1基因低表达及高表达对两株肾癌细胞中MMPs及TIMPs蛋白表达的影响;明胶酶谱实验检测PinX1基因低表达及高表达对两株肾癌细胞MMPs活性的影响。为证实PinX1通过MMP-2调节肾癌细胞的转移能力,在PinX1基因低表达的两株肾癌细胞中加入MMP-2外源性抑制剂阻断MMP-2通路,观察阻断MMP-2通路后低表达PinX1对肾癌细胞迁移和侵袭能力的影响。为证实PinX1通过NF-κB通路调节MMP-2的表达及活性进而调控肾癌细胞的转移能力。Western Blot及RT-PCR检测PinX1基因低表达及高表达的两株肾癌细胞中NF-κB p65的蛋白表达及mRNA的表达;Western Blot检测p65的核、浆分布。对肾癌786-O及ACHN细胞同时转染PinX1 siRNA和p65-siRNA与单独转染PinX1 siRNA的细胞相比较,Western Blot检测PinX1低表达或PinX1和p65同时低表达的肾癌细胞中MMP-2表达的变化。迁移、侵袭实验检测PinX1低表达或PinX1和p65同时低表达的肾癌细胞迁移、侵袭能力的变化。3.包装携带PinX1表达基因及PinX1 shRNA的慢病毒及对照病毒,对肾癌786-O细胞进行转染,构建PinX1高、低表达及对照的肾癌稳转细胞系。Western blot鉴定稳转细胞系PinX1蛋白的表达情况。自裸鼠尾静脉注射PinX1高、低表达及对照的肾癌稳转细胞,建立裸鼠肾癌肺转移模型。2月后处死裸鼠,检测肺部转移瘤情况,对转移瘤进行统计、比较。免疫组化检测转移瘤中PinX1、MMP-2、p65的表达情况。结果1.组织芯片染色显示与正常组织及癌旁组织相比肾癌组织中PinX1表达显著降低;研究PinX1的表达与肾癌临床特征的相关性显示:在试验组中PinX1表达水平与肿瘤浸润程度,区域淋巴结转移及TNM分期呈负相关(Two sided Fisher’s exact tests,P值分别为0.018,0.043和0.013),验证组中PinX1表达水平同样与肿瘤浸润程度,淋巴结转移及TNM分期呈负相关(Two sided Fisher’s exact tests,P值分别为0.001,0.006和0.002);分析PinX1表达水平与肾癌患者预后的关系显示:PinX1表达水平与术后5年总生存时间及疾病特异性生存时间均呈正相关(Log-rank test,P值均为0.002)。单因素及多因素Cox回归分析提示PinX1可作为判断肾癌患者预后的独立预测分子。2.分别使用PinX1 siRNA和pEGFP-C3-PinX1表达载体转染人肾癌细胞786-O和ACHN后Western Blot实验显示:与对照组相比,转染PinX1 siRNA成功降低786-O和ACHN细胞中PinX1的表达,转染pEGFP-C3-PinX1成功在两株肾癌细胞中高表达PinX1;CCK-8增殖实验显示:PinX1基因低表达和高表达对两株肾癌细胞增殖能力的影响均无统计学意义(P>0.05);迁移实验显示,PinX1基因的低表达或高表达可显著提升或抑制肾癌细胞的迁移能力(P<0.001);侵袭实验显示,PinX1基因的低表达或高表达可显著提升或抑制肾癌细胞的侵袭能力(P<0.001);Western Blot实验显示:PinX1低表达或高表达可增强或降低MMP-2的表达,但MMP-9的表达无明显改变,且PinX1基因低表达和高表达对基质金属蛋白酶特异性内源性抑制剂TIMP-1及TIMP-2的表达均无明显影响;明胶酶谱实验显示:PinX1低表达或高表达可增强或降低MMP-2的活性。以上结果提示PinX1基因可抑制肾癌细胞的迁移、侵袭能力,同时抑制其MMP-2的表达及活性,但其对MMP-2的调节是不依赖与TIMP-2的。利用MMP-2的外源性抑制剂处理经PinX1 siRNA沉默的肾癌细胞,Western Blot实验显示经MMP-2外源性抑制剂处理后,因PinX1被干扰后引起的MMP-2表达的上调被阻断;明胶酶谱实验显示:经MMP-2外源性抑制剂处理后,因PinX1被干扰后引起的MMP-2活性的增加被阻断;迁移、侵袭实验显示:肾癌细胞原本因PinX1干扰而提升的迁移、侵袭能力在MMP-2外源性抑制剂处理后又降回至常规水平(P<0.001)。以上结果提示:PinX1可通过MMP-2调节肾癌细胞的转移能力。Western blot检测PinX1低表达和高表达的两株肾癌细胞中NF-κB p65的表达情况显示:PinX1的低表达或高表达可增强或减弱p65的蛋白表达;RT-PCR结果显示:PinX1的低表达或高表达可增强或减弱p65的mRNA的表达水平;Western blot检测PinX1低表达的两株肾癌细胞中p65发生了明显的核转位。这表明PinX1低表达可以上调p65的转录并增加其核转位,从而激活NF-κB通路的转录活性。NF-κB p65 siRNA与PinX1 siRNA共转染肾癌786-O及ACHN细胞,与PinX1 siRNA单独转染细胞对比,Western blot结果显示:PinX1干扰后MMP-2表达水平上调,而当PinX1和p65双干扰后MMP-2表达又回调至正常水平;迁移、侵袭实验结果显示:PinX1干扰后肾癌细胞的迁移、侵袭能力均明显增加(P<0.001),而当PinX1和p65双干扰后细胞的迁移、侵袭能力又回调至正常水平(P<0.001)。以上结果进一步提示PinX1可通过NF-κB/MMP-2信号通路调节肾癌细胞的迁移、侵袭能力。3.包装携带PinX1表达基因或PinX1 shRNA的慢病毒,对肾癌786-O细胞进行转染,构建PinX1高表达及低表达的肾癌稳转细胞系。Western blot结果显示:PinX1高、低表达的肾癌稳转细胞系成功过表达或敲减了PinX1。裸鼠肾癌肺转移模型建立2月后,处死并解剖裸鼠,肺组织石蜡切片H&E染色显示:肺部新生结节为肾癌转移瘤;对各组肺部转移结节进行统计,结果显示:PinX1低表达组的裸鼠肺转移结节数明显多于PinX1高表达组及对照组,且各组间均存在显著差异(χ~2 test,P<0.001);免疫组化显示:PinX1高表达或低表达组的转移瘤中MMP-2及p65同时呈低表达或高表达,且TIMP-2的表达无明显变化。以上结果进一步在体内验证了PinX1通过NF-κB/MMP-2信号通路调节肾癌细胞转移能力的机制。结论综上所述,我们在该研究中得出的结论是:与正常肾组织及癌旁组织相比肿瘤组织中PinX1表达降低,且其降低与淋巴结转移,肿瘤TNM分期及患者预后不良高度相关,Cox回归分析提示PinX1可作为独立预测分子判断肾癌患者的预后。体内及体外实验证实,PinX1可通过NF-κB/MMP-2信号通路调节肾癌细胞的转移能力。我们的工作对以后研究PinX1在肿瘤转移中的作用提供了重要的线索,并有望为肾癌的分子诊断和基因治疗提供新的靶点。