CatSper家族特异性表达于精子,并为雄性生育所必需,这使研究者们认为有两方面的应用前景:作为男性不育病因检查的切入点和理想的避孕靶点。本论文分两部分分别对这两方面作了一些前期的探索性研究。第一部分CatSper家族mRNA在小鼠睾丸发育和人精子中的表达实验一、CatSper家族mRNA在小鼠睾丸发育过程中的表达背景与目的: CatSper家族的四个成员被认为是形成异四聚体而行使其功能,但近期对于CatSper家族四个成员表达定位的争论,及其他能与CatSper结合的蛋白的发现,使CatSper家族四个成员的关系变得复杂和不明确。本实验目的是通过定量检测和比较CatSper家族四个成员的mRNA在小鼠睾丸发育过程中的动态变化,明确CatSper家族成员在睾丸发育中的表达模式,为进一步研究CatSper家族成员间的关系及其功能单位,以及研究和应用CatSper提供实验依据。方法:在普通逆转录—多聚酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)体系中添加荧光染料SYBR GREENⅠ建立荧光实时RT-PCR体系,以β-Actin作为内参,用相对定量法检测CatSper家族四个成员的mRNA在出生后8,11,15,18,21,25,28,35,42,56和120d龄C57BL/6小鼠(每天龄3只)睾丸发育过程中的表达。荧光实时RT-PCR循环采用四步法,即在靠近扩增产物Tm值前采集荧光,以消除引物二聚体及非特异性产物的影响。结果: CatSper家族四个成员的mRNA在小鼠睾丸发育中共有三种不同的表达模式,主要表现在转录启动及上调时间点的不同:1)CatSper1 mRNA在18d龄小鼠睾丸(减数分裂后)开始表达,在25d、28d龄和42d龄表达明显上调,与各自前一时间天龄小鼠睾丸相比,差别有显著性意义(P<0.001, P<0.005, P<0.05)。自42d后上调缓慢,至成年小鼠时达到最高水平。2)CatSper2 mRNA在8d龄小鼠睾丸(减数分裂前)就可被检测到,继而在18d、35d龄表达明显上调,与各自前一时间天龄小鼠睾丸相比,差别有显著性意义(P<0.001)。35d后水平稍下降,因此,CatSper2 mRNA表达高峰在35d龄。3)CatSper3和CatSper4 mRNA在小鼠睾丸发育过程中的表达启动及调节模式相似:在15d龄小鼠睾丸(减数分裂后)表达启动,在21d、25d龄和35d龄表达明显上调,与各自前一时间天龄小鼠睾丸相比,差别有显著性意义(P<0.005, P<0.05, P<0.001),之后表达逐渐上调,至成年小鼠时达到最高水平。结论: CatSper家族四个成员的mRNA在小鼠睾丸发育中有不同表达模式,为进一步研究CatSper家族成员间的关系及其功能单位提供实验依据,也为研究和应用CatSper家族奠定一定基础。实验二、CatSper家族mRNA在人精子中的存在及与精子活力的关系背景与目的:近二十年以来,哺乳动物成熟精子中存在很多基因的mRNA已被证实和接受。虽然对于成熟精子中这些mRNA的来源及其意义还有争论,但一般认为成熟精子作为转录已经停止的高度特化的细胞,这些mRNA是精子发生过程中的“残余物”,检测其水平能反映睾丸精子发生过程中的表达事件,是睾丸穿刺的替代物。已有研究表明,一些男性不育患者睾丸组织CatSper的表达异常,但睾丸穿刺不易被人们所接受。本实验的目的是检测CatSper家族四个成员的mRNA在人成熟精子中存在的情况,并探讨人射出精子CatSper家族mRNA水平与精子质量的关系,以及CatSper家族在人精子前向运动中的作用,为CatSper家族作为男性不育病因检查和研究提供一个新的靶点和途径。方法:参照世界卫生组织标准选取正常精液标本,为明确CatSper家族mRNA是否存在于人射出精子中,关键是要排除精液中睾丸生精细胞的污染。采用Percoll(80%和40%两个浓度)纯化精子两次,显微镜下确认纯化效果后用于提取RNA。用普通RT-PCR检测CatSper家族mRNA是否存在于人射出精子中,并同步扩增C-Kit,排除精液中睾丸生精细胞的污染。为比较高、低活力精子中CatSper家族mRNA水平的差异,正常精液标本用四层密度梯度Percoll(自下而上浓度分别95,76,57和47.5%)离心分离出高活力和低活力精子。要求低活力精子a+b级精子活力小于30%,且高活力精子a+b级精子活力大于90%,低活力精子和高活力精子的存活率均大于85%。同上排除精液中睾丸生精细胞的污染,提取RNA,以β-Actin作为内参,荧光实时RT-PCR(四步法)相对定量法检测CatSper家族成员的mRNA在高活力和低活力精子中的水平并比较。结果:共对5例标本进行了纯化,均达到纯化标准并用于检测CatSper家族成员mRNA存在情况。这5例标本均检测到CatSper2和CatSper3的mRNA存在,而仅在2例标本中检测到CatSper1 mRNA的存在,这5例纯化精子标本中均未检测到CatSper4 mRNA的存在。共对12例标本进行了高、低活力精子的分离,有10例达到纯化标准及活力、存活率的要求,用于检测了CatSper家族成员在高、低活力精子中的mRNA水平。CatSper2、3 mRNA的水平在各标本中的变化范围较大,经β-Actin标准化后,各标本间仍有数倍乃至数十倍的差异,但仍呈正态分布。除了有一例标本低活力精子中CatSper3 mRNA的水平略高于高活力精子外(0.88 vs. 0.82),在其他标本中,低活力精子中CatSper2、3 mRNA的水平均低于高活力精子。经配对t检验,高、低活力精子间,CatSper2、3 mRNA的水平差异有显著性意义(P<0.01)。高活力和低活力精子的活率差异无显著性意义(92.6±1.6 vs. 91.7±1.7, P=0.228)。结论:为应用人成熟精子CatSper家族mRNA作为不育病因检查和研究提供实验依据和参考,精子中CatSper2和CatSper3 mRNA水平检测可考虑作为男性不育,尤其是弱精子症病因检查的新靶点。但CatSper2和CatSper3 mRNA水平存在较大的个体差异,所以,研究其与不育的关系可能需要较大的样本。第二部分CatSper1用于免疫避孕的探索性研究实验一、CatSper1在人睾丸、精子中的表达背景与目的: CatSper1是CatSper家族第一个被发现的成员。CatSper1在小鼠精子中的表达、定位及在小鼠精子生理功能中的主要作用已基本明确,并被认为是避孕及男性不育研究的理想靶点,但目前尚未见CatSper1在人精子中表达及其功能的报道。本实验的目的是明确CatSper1在人睾丸、精子中表达及定位,为CatSper1的应用研究奠定基础。方法:用Western Blot和间接荧光免疫组织化学检测人睾丸组织和Percoll(80%和40%两个浓度)纯化人精子中CatSper1蛋白的表达。结果: CatSper1蛋白在人睾丸组织及人成熟精子中都有表达,在人睾丸表达于精子细胞,并定位于射出成熟精子尾部的主段。结论: CatSper1蛋白在人类睾丸呈减数分裂后表达方式,与小鼠CatSper1转录启动于减数分裂后的结果相吻合;CatSper1蛋白在人精子表达的定位也与小鼠相同。这些都提示,CatSper1在人精子中的功能可能与小鼠是相同的。实验二、CatSper1用于免疫避孕的体外试验研究背景与目的:目前尚未见以CatSper1为靶点进行避孕研究的报道,也没有特异性的拮抗剂。作为在精子功能及精卵结合方面起重要作用,且定位于精子膜上的精子特异性抗原,我们推测免疫避孕可能成为可行有效的途径。离子通道自身免疫性疾病也表明,用针对离子通道的抗体阻断其功能是有效可行的。本实验的目的是通过观察抗CatSper1跨膜区及胞外段的抗体在体外对人精子功能和小鼠精子体外授精能力的影响,探讨CatSper1跨膜区及胞外段用于免疫避孕的可能性,明确CatSper1用于免疫避孕的主要作用环节,也间接研究人精子CatSper1的功能。方法:间接荧光免疫组织化学方法检测本实验所用的抗CatSper1多克隆抗体(所针对抗原为CatSper1的跨膜区及胞外段)与人、小鼠精子结合的特异性。按世界卫生组织标准选取正常精液标本,经SpermRinse上游优化,与抗CatSper1多克隆抗体(终浓度为50μg/ml)孵育,显微镜下观察抗CatSper1多克隆抗体是否引起精子凝集,计算机辅助精液分析系统检测抗体对精子活力和超活化运动的影响,考马斯亮兰G250染色观察抗体对顶体反应的影响。取BALB/c小鼠附睾尾部精子,在授精前与抗CatSper1多克隆抗体(终浓度为50μg/ml)孵育90 min,观察抗体预处理对精子体外授精能力的影响。结果:实验所用的抗CatSper1多克隆抗体与人和小鼠精子均结合于精子尾部主段,未发现非特异性结合。终浓度为50μg/ml的该抗体和精子体外培养:1)2 h后,显微镜下无精子凝集发生。2)1 h、2 h、4 h后,活力下降,与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.005)。且活力的降低主要表现为a级精子(快速前向运动精子)减少,与对照组相比,各时间点的差异均有显著性意义(P<0.01或P<0.005)。3)4 h后,对精子顶体反应无明显影响(P=0.61)。4)5 h后,对精子超活化运动有明显抑制作用(P<0.05)。BALB/c小鼠精子,在授精前经50μg/ml抗CatSper1多克隆抗体预处理90 min,受精率为45.8%(77/168),与对照组相(80.4%, 123/153)比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:本实验首次以精子特异性离子通道为靶点,体外探讨了CatSper1用于免疫避孕的可能性和有效性。抗CatSper1跨膜区及胞外段的抗体通过特异性结合于精子CatSper1的相应区域,阻断CatSper1的功能,从而抑制精子生理功能和体外授精能力。本实验结果也表明,用抗体影响精子膜上的离子通道功能是可行有效的,这为研究精子膜离子通道的功能提供一种参考方法。