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糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor,GR )为核受体超家族成员之一,与盐皮质激素受体(MR)、雄激素受体(BAR)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)共属甾体激素受体亚家族。一般认为,GR为典型的激素依赖性转录调节因子,与激素结合后通过和靶基因中的糖皮质激素(glucocorticoid, GC)反应元件(GRE)相互作用,调节靶基因的表达,并最终引起各种生物学效应,这也被称为GC的基因组效应,是GC经典作用模式;然而,近年来越来越多的证据表明GC对激素分泌、神经元兴奋性、机体行为及细胞形态、糖类代谢等具备快速调节作用,这些过程往往在数秒钟或者分种内完成,这种作用机制被称为GC的非基因组作用机制。同时由于这些效应通常是在应用GC较短的时间内发生,因此也被称为GC的快速效应。目前仍不太清楚GC快速效应的作用机制,但一般认为可能通过特异性受体或依赖激素本身的脂溶性特性发挥非基因组效应,目前有多项报道显示,GC可能通过与GR的不同剪切体作用后发挥不同的作用。大鼠GR mRNA于1985年被克隆以来,虽有有关可能存在不同GR剪切体的报道,并且通过提取大鼠、小鼠不同组织的蛋白质进行鉴定,发现在蛋白质水平可能存在不同分子量的GR,但一直未见成功克隆出新的GR剪切体的报道。我们在进行酵母双杂交研究RGS4与GR各结构域之间的相互作用的试验中,发现一种新的GR mRNA序列,将该序列连接到pGAD-T7载体上,通过对插入片段进行序列测定,得到该序列的克隆。该新发现GR cDNA序列和已经报道的GR mRNA序列相比,该序列在转录调节域(GR-AB段)缺失42个碱基,缺失碱基为一段编码谷氨酰胺的重复序列,新发现GR-短mRNA可能是一种新的GR mRNA剪切体。本研究在GR-新序列和GR老序列不同源区域附近设计内外两对引物,首先利用外对引物分别从基因组DNA和pGAD-T7-sAB短中扩增出GR-长和GR-短片段,以此长、短片段为模板用生物素标记的内对引物扩增出GR-长和GR-短探针,琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺电泳鉴定产物大小,并检测制备探针的生物素活性。以制备的长、短cDNA为探针,分别经Dot Blot、Northern Blot检测SD大鼠正常组织中新发现的GR mRNA(GR新mRNA,GR短)、已经公布的GR mRNA(GR老mRNA,GR短)的分布。Dot Blot检测结果表明,GR新mRNA在组织中的分布情况:肺>脑>肾>肝;GR老mRNA脑组织中最多,肝最少,肺和肾中基本相当。Northern Blot试验结果显示,6.3Kb处检测出新、旧两条不同GR mRNA剪切条带。其中GR老mRNA在SD大鼠组织分布情况是心<肝<肾<肺<脑;而GR新mRNA的分布则是心<肝<脑<肾<肺。原位杂交试验检测GR新、老mRNA在大鼠心、肝中的表达的结果显示,长、短探针在心肌细胞和肝细胞中都有阳性信号,提示GR新、老mRNA在心肌细胞和肝细胞中都有表达。为探讨新、老两种GR剪切体是否具有功能差异,本试验设计两条全硫代修饰的反义寡核苷酸(AS-ODNs),以其抑制新、老GR mRNA的表达来观察GR介导的生物学效应变化。试验采用SD大鼠肝细胞株,分为空白组(只加脂质体)、对照组(脂质体+无意义链寡核苷酸)、GR长AS-ODNs组(脂质体+GR长AS-ODNs)和GR短AS-ODNs组(脂质体+GR短AS-ODNs)等四组,每组转染后细胞培养24h,提取总RNA。荧光定量PCR检测SD大鼠GR mRNA和GAPDH的表达情况,通过测定出的GR相对荧光值和GAPDH相对荧光值的比值,反应各组GR mRNA表达水平。结果显示,同空白组相比,无意义链组、GR长AS-ODNs组及GR短AS-ODNs GR mRNA表达显著降低(P<0.05),但无意义链组、GR长AS-ODNs组及GR短AS-ODNs组之间无显著差异。验结果表明,目前尚不能成功利用AS-ODNs抑制GR新、老mRNA的剪切和翻译。本试验主要在mRNA水平上证实了新发现的GR mRNA剪切体的存在,并对其组织分布进行了观察,发现该GR mRNA的分布与经典GR的组织分布有所不同,两种不同mRNA组织分布的差异是否与糖皮质激素在不同组织中的功能差异有关尚需要进一步的试验来证实。由于新GR剪切体与经典GR的序列差异主要在功能调节域,因此通过传统的GR阻断剂RU486难以鉴别两种GR的功能差异,需要从mRNA水平来改变两种GR的蛋白表达量,从而鉴别两种GR功能上的差异,为此,本研究分别针对两种不同mRNA的反义寡核苷酸,试图通过抑制不同的GR mRNA来验证其功能上是否存在差异。但从目前结果来看,尚需要对反义寡核苷酸的序列进行优化,以达到特异性抑制的目的,或者选用其他的试验方法从其他角度来研究二者的功能。本研究为日后探索糖皮质激素的基因组或非基因组作用机制奠定了一定的试验基础。