单环刺螠体表黏液的制备与自溶现象的研究

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单环刺螠是一种生活于浅海泥沙底质中的经济类海洋无脊椎动物。前期研究发现单环刺螠的体外分泌物具有一定的抗菌活性,能够避免洞穴周围污染物的积累和有害微生物的生长;同时还发现单环刺螠存在自溶现象,即当其体壁遭受损伤后,容易产生体壁穿孔、内脏泄露,最终导致整体液化的现象。本研究针对这两种现象,建立单环刺螠体表黏液的制备方法,分析其黏液的抗菌活性;纯化单环刺螠内脏中具有溶解体壁作用的蛋白酶,分析其作用条件和主要构成,研究其自溶机理,进而探索单环刺螠体表黏液和自溶酶在医用材料、食品加工等方面的应用前景。利用微电流刺激法,结合建立的简易收集装置,收集单环刺螠的体表黏液;黏液经冷冻干燥后,采用滤纸片—抑菌圈法测试其对大肠杆菌、溶血性链球菌、鲍曼不动杆菌和痤疮丙酸杆菌等的抑菌活性;分析其溶血活性。取清洗后的单环刺螠内脏匀浆、浸提,上清用饱和硫酸铵溶液低温沉淀,透析得到粗酶溶液;以单环刺螠的体壁为底物,分析其最佳酶解条件及稳定性;以荧光酪蛋白为底物,证实其具有丝氨酸蛋白酶活性;通过Sephadex G-100对粗提物进行分离,SDS-PAGE确定分子量;通过血细胞计数板计数法,探究该类酶对于小球藻细胞的破壁作用。通过实验得到如下结果:(1)用于单环刺螠体表黏液收集的最适刺激电压为6V,最适刺激温度为4℃;黏液的最高制备量为3.291g,得率合1.533%;该黏液具有一定的抑菌活性,0.4g/m L浓度下对大肠杆菌、溶血性链球菌、鲍氏不动杆菌有一定的抑制效果;该黏液具有一定的抗凝血效果。(2)经饱和盐溶液沉淀、透析过滤后得到的源自单环刺螠内脏蛋白溶液具有一定的自溶酶活性;SDS-PAGE测试其平均分子量约为8k Da;酶活分析显示其具有较好的热稳定性,80-100℃热处理2h仍可保持约80%的酶活性;其对单环刺螠体壁具有降解能力,在70℃、p H为9时酶解效果最好;金属离子Pb2+能够抑制该酶的活性,Ca2+、Zn2+有助于提高该酶的活性;组织切片显示,该类酶可破坏单环刺螠体壁的正常结构;且在体外能够降解小球藻的细胞壁;推测单环刺螠的自溶过程中,至少存在由该类酶的内源性泄露所引发的组织结构失稳现象。通过实验得出如下结论:(1)建立并优化了单环刺螠体表黏液的制备方法;(2)单环刺螠体表黏液具有一定的抑菌和抗凝血功能;(3)建立了单环刺螠自溶酶系的提取及纯化工艺;(4)该自溶酶系中具有丝氨酸蛋白酶,可通过溶解、破坏体壁的纤维结构、使体壁失去稳态;(5)明确了单环刺螠发生自溶的主要机理之一:损伤导致内脏酶类释放,溶解体壁造成体壁穿孔,内脏泄露加剧,造成整体液化;(6)该自溶酶系对部分藻类细胞具有较好的溶解和破壁效果。
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