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斯钙素(Stanniocalcin,STC)是最早在鱼类中发现一种糖蛋白激素,起调节钙/磷平衡的作用。血清钙升高可以引起斯钙尼氏小体释放STC-1,钙离子流通过鱼鳃、肠来保持血液中钙离子浓度的稳定。近年来在人和其它哺乳动物中也发现STC,先后分别命名为STC-1和STC-2。这两种基因在大部分组织中广泛表达,它们主要通过自分泌/旁分泌方式来调节动物机体多个生理功能,其中STC-1基因主要功能是通过调控钙/磷平衡、调控体内骨代谢以及通过线粒体中解偶联蛋白阻碍三磷酸腺苷酸(ATP)正常产生,从而影响生长发育。本研究通过构建STC-1基因过表达载体和设计合成的STC-1 siRNA载体分别上调和下调STC-1基因的表达,在细胞水平上检测STC-1基因对线粒体功能的影响。通过巴马猪和大白猪两种不同体型猪中STC-1基因及其与细胞代谢、生长发育相关基因表达水平分析,研究这些基因的表达特征。通过对上述基因生理功能和其调控机制的分析以及鉴定影响猪体型发育的新通路,为初步阐明不同体型猪发育差异的遗传学机制提供了理论基础。主要研究内容和结果如下:1.猪STC-1基因对细胞线粒体功能的影响本研究根据猪肌肉斯钙素(STC)mRNA序列设计了 3对小干扰RNA(Smallinterfering RNA;siRNA)、阴性对照siRNA。转染PK15细胞(猪肾细胞)后,通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率和基因表达效率,利用QRT-PCR与Western-blot测定细胞内siRNA基因沉默后STC-1 siRNA表达水平与STC-1蛋白的表达量。结果表明,成功设计了猪STC-1 siRNA引物序列,在细胞水平对该基因沉默效率进行了检测,证明设计的STC-1 siRNA均能对STC-1进行基因沉默,其中STC1-132基因沉默效率最好。将筛选出的STC-1 siRNA沉默效果好的基因(siSTC组)与构建的STC-1基因过表达载体(STC组)转染PK15细胞后,通过Westernblot分别检测STC组与siSTC组的STC-1蛋白、线粒体相关蛋白及乙酰化的表达量。结果显示,STC-1基因过表达或沉默能显著上调或下调PMP70、OPA、DRP、mfn的表达水平。利用流式细胞仪分别检测各组细胞凋亡、线粒体膜电位、活性氧(ROS)、ATP等相关理化指标,以及用透射电镜观察各组细胞线粒体结构和形态的变化。结果显示,STC-1基因过表达和基因沉默后都可以降低细胞凋亡率和活性氧生成,显著提高细胞膜电位,大幅度降低细胞内ATP的生成,同时也可影响线粒体的形态结构和数量。说明STC-1基因表达水平的变化和线粒体功能密切相关,该基因在维持线粒体正常功能方面可能发挥一定的作用。2.猪STC-1基因及其信号通路相关蛋白在不同体型猪中表达模式检测本研究分别采集巴马猪和大白猪的肺脏、肾脏、软骨、肝脏、脾脏、肌肉、心脏等组织,运用Western blot分别对大小体型猪中多组织的STC-1蛋白与线粒体融合蛋白OPA、Mfn、DRP以及线粒体能量代谢蛋白PMP70表达进行检测。并对STC-1基因进行表观遗传学检测。结果表明,大小体型猪多组织尤其是骨骼肌、心肌及软骨组织中的STC-1蛋白与线粒体融合蛋白OPA、Mfn、DRP以及线粒体能量代谢蛋白PMP70的表达有显著差异。上述蛋白在巴马猪多组织中显著高于大白猪,初步说明STC-1基因及其信号通路基因可能与猪的体型发育有一定关联。