随着抗生素的大量使用,近年来革兰阴性杆菌在临床分离率和耐药率呈逐年上升趋势,其中最主要为不动杆菌属细菌和铜绿假单胞菌。不动杆菌属细菌为条件致病菌,广泛分布于水、土壤、医院环境和人体皮肤表面。不动杆菌属中以鲍曼不动杆菌最为常见,目前已成为继大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌之后的重要临床分离菌。多重耐药不动杆菌已经在世界各地出现,甚至暴发流行。因此,加强细菌耐药监测,研究多重耐药分子机制是必须的。本论文筛选出2007年8月到2008年5月多重耐药不动杆菌并进行流行病学研究。通过研究多重耐药不动杆菌中整合酶、整合子可变区基因,来分析整合子结构确定整合子在不动杆菌多重耐药中的作用。最后通过16S rRNA甲基化酶基因的扩增分析我院多重耐药不动杆菌对所有氨基糖苷类高水平耐药的原因。一、多重耐药不动杆菌的耐药性及菌株同源性研究利用K-B纸片扩散法从我院2007年7月-2008年5月临床分离的不动杆菌中筛选出61株多重耐药菌株,同时对三种不同类抗生素耐药的为多重耐药菌株。PCR扩增OXA-51-like和16S rRNA-23S rRNA基因并且进行基因序列分析将细菌鉴定到种。结果显示61株多重耐药不动杆菌中有55株鲍曼不动杆菌,3株3TU不动杆菌,1株13TU不动杆菌,1株醋酸钙不动杆菌,1株溶血不动杆菌。琼脂稀释法测定14种临床常用抗菌药物对多重耐药不动杆菌的耐药表型。MIC结果显示多重耐药不动杆菌对多粘菌素E耐药率最低为9.7%,头孢哌酮/舒巴坦耐药率为32.3%,米诺环素耐药率16.1%,亚胺培南耐药率为45.2%,对所有氨基糖苷类抗生素耐药率高达90.0%以上。脉冲场凝胶电泳对其进行同源性分析。条带分析发现这61株菌株分为5个克隆,其中A、B为主要克隆株,多重耐药鲍曼不动杆菌在我院已经出现大范围传播,需采取有效措施进行干预。二、不动杆菌整合子的结构分析与耐药相关性研究设计整合酶基因特异性引物对61株多重耐药不动杆菌中整合酶基因进行PCR扩增;利用统计学软件分析整合子阳性菌株与整合子阴性菌株对各临床常用抗生素耐药率之间的差异;以整合子阳性菌株为研究对象,用PCR扩增和步移法测序测定整合子可变区基因盒,通过序列比对分析了解内插耐药基因盒的情况,分析整合子结构。结果显示61株多重耐药菌株中50株1类整合酶阳性(阳性率82%),未检测出2、3类整合酶;对1类整合子阳性和阴性菌株不动杆菌耐药率分析发现,整合子阳性菌株对氨基糖苷类和喹诺酮类的耐药率明显高于整合子阴性菌株,(P<0.05)。对50株整合酶阳性菌株进行可变区基因扩增,27株出现1000-4000bp大小不等的片段,其中13株菌株携带aacA4、catB8、aadA1基因,9株菌株携带aacC1、orfX、orfX′、aadA1基因,4株菌株携带arr-3、aadA4基因,1株菌株携带dfrA12、orfF、aadA2基因,主要介导氨基糖苷类、氯霉素、利福平、磺胺的耐药。三、介导氨基糖苷类高水平耐药的16S rRNA甲基化酶的研究PCR扩增6种导致氨基糖苷类高水平耐药的16S rRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA基因,PCR阳性条带进行基因测序和序列比对。61株不动杆菌中47株armA型16S rRNA甲基化酶基因阳性菌株(阳性率为77%),这解释了我院不动杆菌氨基糖苷类的高水平耐药的现状。接合和质粒抽提实验阴性。其余5种16S rRNA甲基化酶基因均为阴性。