论文部分内容阅读
研究目的肿瘤是全球面临的最主要的健康问题之一,目前许多肿瘤尚无切实有效的治疗方法。当前,手术治疗、放疗和化疗是临床上抗肿瘤的三大传统治疗手段。传统治疗方法因副作用、疗效不一和并发症等因素受到诸多限制。随着肿瘤分子分型的发展,靶向药物正逐步代替传统化疗药物成为肿瘤学研究中的热点。相比传统化疗药物,靶向药物具有靶向性强、副作用小、有效改善患者生存质量等优势。肿瘤药物靶点筛选和靶向药物寻找逐步成为肿瘤学研究中的热门领域。上世纪七十年代,两届诺贝尔获奖者Linus Pauling就曾根据实验提出维生素C（VitminC,VC）对肿瘤具有治疗作用,但随后的大规模临床实验结果并没能支持该论点。近年来,国内外研究表明VC对多种肿瘤均具有抑制或者辅助治疗作用。Yun J等人[1,2]研究发现,KRAS或者BRAF突变的结直肠癌细胞高表达葡萄糖转运蛋白（glucose transporter,GLUT1）,进一步的研究发现GLUT1对氧化型维生素C（dehydroascorbate,DHA）具有转运作用,可将胞外的DHA转运至胞内;进入胞内的大量DHA容易分解,形成VC的同时导致活性氧（reactive oxygen species,ROS）的升高,消耗大量还原物质谷胱甘肽（glutathione,GSH）和还原型磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）,从而消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）,使甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）活性受到抑制,糖酵解途径受阻,耗尽ATP,最终导致细胞死亡。Yun J等人[1]继续用含有相同KRAS或者BRAF突变基因的结直肠癌细胞株进一步实验:在未加入还原剂的情况下,VC在细胞培养基中被氧化为DHA;在两组细胞株内分别加入还原剂GS H或GLUT1抑制剂STF,结果表明两组实验细胞株内的VC摄入明显减少;第三组细胞株中的GLUT1去除后加入VC,发现VC的摄入同样明显降低。考虑到GL UT1在突变基因细胞中的增强表达,将对照组普通细胞株中的GLUT1增加到与突变组等量的情况下观察,VC的摄入并没有明显的增加。因此,他们得出在KRAS或者BRAF突变基因的结直肠癌细胞株中GLUT1能使VC转运到细胞内,而且V C需要氧化成DHA才能被GLUT1转运,只有在突变基因株中VC的摄入会增高。既往研究口服VC无法在体内实现抗肿瘤的目的,静脉输注VC可以突破口服时血药浓度的限制,使得血液VC水平高于口服摄入的100-500倍,可能正是这种超高浓度的VC成了攻击癌细胞能力的关键。如果VC可以成为一个全新的肿瘤靶向药物,那将是肿瘤患者的福音。根据以上研究,我们进一步探讨（1）各肿瘤细胞中GLUT1的表达情况以及在其它肿瘤细胞中GLUT1能否使VC转运到细胞内?（2）如果GLUT1高表达或DHA浓度增加,DHA的摄入是否会增加?（3）利用HBO增加肿瘤微环境中的氧化应激,是否会通过增加DHA,进而增强抗肿瘤的效果?据此,我们在体外细胞实验的基础上,通过构建裸鼠模型,对VC联合HBO抗肿瘤的有效性做一初探,为临床VC联合HBO治疗肿瘤提供理论依据。研究方法（一）维生素C对细胞增殖作用的检测1、利用qRT-PCR技术对13种33株不同肿瘤细胞系GLUT1相关编码基因进行初步检测,根据筛选结果选择GLUT1高表达以及GLUT1低表达肿瘤细胞用于后续对照实验。2、选择GLUT1高表达肿瘤细胞,分别加入不同浓度的还原型VC、DHA,利用MTT法检测12、24、48h后细胞增殖活性,筛选合理的VC浓度及作用时间用于后续实验。3、用筛选得到的合理浓度的还原型VC及DHA分别对GLUT1高表达、GLUT1低表达肿瘤细胞进行处理,设置只用PBS处理的对照组,利用MTT法检测细胞增殖活性。4、倒置显微镜下观察肿瘤细胞形态学改变,并观察细胞膜、细胞质及细胞核的变化。5、用GLUT1慢病毒转染GLUT1高表达肿瘤细胞下调GLUT1 mRNA的表达,再次分为对照组、还原型VC组、DHA组进一步验证,MTT法检测细胞增殖活性。（二）裸鼠肿瘤模型的建立构建裸鼠皮下移植瘤用PBS调整细胞浓度为1×107ml-1,在裸鼠背部接种GLUT1高表达肿瘤细胞悬液0.2ml/只。接种裸鼠25只,长出移植瘤后随机分组,每组5只:对照组（control组,n=5）、高压氧组（HBO组,n=5）、大剂量还原型VC组（VC组,n=5）、HBO联合大剂量还原型VC组（HBO+VC组,n=5）。记录每天观察小鼠食欲、活动度及成瘤的情况;分别于1、2、3、4周测量小鼠肿瘤长短直径（a,b）,根据公式ab2/2计算肿瘤体积变化情况;4周后以断颈处死小鼠,完整剥离肿瘤组织,称瘤重。应用统计学分析（P<0.05）为差异有统计学意义。实验结果1、13种33株不同肿瘤细胞系均可检测到GLUT1表达,但是表达水平差异明显。我们选择GLUT1高表达的肺癌A549细胞以及GLUT1低表达的肺癌H1299细胞作为研究对象。2、采用MTT法对肺癌A549细胞增殖活性检测,结果显示还原型VC、DHA对A549细胞增殖均有抑制作用,总体在一定范围内随着VC剂量的增加细胞增殖抑制率也明显增加。同一浓度,同一时间内,与对照组相比,DHA对肺癌A549细胞具有明显的抑制作用（P=0.04）;DHA组与还原型VC相比,对A549细胞增殖显著抑制（P=0.03）;同一浓度,同一时间内,与对照组相比,DHA、还原型VC对H1299细胞增殖均无明显抑制（P>0.05）,与还原型VC相比,DHA组对H1299细胞增殖无明显抑制（P>0.05）。3、利用GLUT1慢病毒感染肺癌A549细胞后,利用qRT-PCR检测siR-GLUT1 A549,GLUT1 mRNA表达下调80%。再次用同样的处理方式（对照组PBS及相同浓度还原型VC、DHA）处理后,结果显示与对照组相比,DHA与还原型VC组对siR-Glut1A549细胞增殖无明显抑制;与还原型VC相比,DHA对siR-Glut1A549肿瘤细胞增殖抑制作用无明显差异。4、体内实验显示,从给还原型VC后第1周开始,小鼠肿瘤体积较前增长,对照组、HBO组肿瘤体积明显增大;大剂量还原型VC组的肿瘤体积、大剂量还原型VC联合HBO组的肿瘤体积较前稍有增加,比前两组增长少。VC联合HBO组与对照组体积、瘤重差异有统计学意义（P<0.05）;VC联合HBO组与还原型VC瘤重、体积相比有协同趋势,但无统计学意义（P>0.05）。结论1、各肿瘤细胞均表达GLUT1,但是表达水平差异明显;我们成功筛选出了GLUT1高表达的肺癌A549及GLUT1低表达的肺癌H1299肿瘤细胞。2、在肺癌A549细胞中,GLUT1转运DHA进入细胞;GLUT1高表达或DHA量增加,则DHA摄入增加。3、与单独还原型VC相比,还原型VC联合HBO具有协同抗肿瘤的趋势,但无统计学意义。