【摘 要】
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目的:砷是广泛存在于自然界的类金属元素,且位列美国毒物和疾病登记署（America Toxicology and Disease Registry,ATSDR）有毒化学清单之首。饮水型砷中毒累计全球70多个国家和地区,是众所关注的重要公共卫生问题。发育期砷暴露会持续影响机体健康,导致不良出生结局和成年期的疾病效应。表观遗传修饰被认为是发育期砷暴露引起成年期疾病易感性升高的主要机制之一,但具体机制尚
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（82022063;81573187;81830099）； 科技部重点专项（2018YFC1311600）；
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目的:砷是广泛存在于自然界的类金属元素,且位列美国毒物和疾病登记署（America Toxicology and Disease Registry,ATSDR）有毒化学清单之首。饮水型砷中毒累计全球70多个国家和地区,是众所关注的重要公共卫生问题。发育期砷暴露会持续影响机体健康,导致不良出生结局和成年期的疾病效应。表观遗传修饰被认为是发育期砷暴露引起成年期疾病易感性升高的主要机制之一,但具体机制尚不清楚。DNA甲基化和miRNA的改变是表观遗传修饰的重要组成部分,其失调与疾病发生密切相关。Nrf2是抗氧化反应体系的关键转录因子,且可被无机砷暴露激活。DNA甲基化与疾病的关系日益受到人们的关注。本研究利用发育期环境相关水平砷暴露小鼠模型,对断乳小鼠肝脏进行全基因组DNA甲基化水平和miRNA表达的检测,以及DNA甲基化在发育期砷暴露所致的Nrf2表达升高中的作用研究,分析发育期砷暴露对断乳小鼠DNA甲基化和miRNA表达影响的特征,进一步揭示发育期砷暴露诱导Nrf2表达的机制。研究方法:1.本研究以雄性断乳期（4周龄）C57BL/6J小鼠为研究对象,建立的发育期（精子形成期,妊娠期和哺乳期）饮水型砷暴露小鼠模型。亲代小鼠配对前5周（精子生成期）开始通过饮用水给予0.5 ppm砷暴露【亚砷酸钠（NaAsO2）:砷酸钠（Na2HAs O4）=1:1】,直至子代小鼠断乳（4周龄）结束;对照组小鼠饮用双蒸水。小鼠均自由摄食饮水。收取子代断乳期小鼠肝脏进行研究。2.差异miRNA筛选与分析:采用高通量miRNA基因芯片技术对小鼠肝脏进行检测,利用R/Bioconduct中的Limma软件包分析两组之间的miRNAs表达谱差异,分别使用Pheatmap和ggplot软件包构建差异miRNAs的热图和火山图;采用在线软件DIANA miRPath v.3对差异miRNAs进行KEGG通路分析,选择具有统计学意义（P<0.05）的联合途径进行热图绘制。3.miRNA的验证:利用RT-qPCR验证miRNA芯片的可靠性,采用随机数字表法选择9个差异miRNA进行验证。4.全基因组DNA甲基化相关检测:El ISA法检测小鼠肝脏5-甲基胞嘧啶含量（5-m C%）;Western blot和RT-qPCR技术检测DNA甲基化转移相关酶（DNMT1,DNMT3a/b）的蛋白和mRNA表达,DNA去甲基化酶（Tet1,Tet2,Tet3）的mRNA表达。5.Nrf2 mRNA和蛋白表达:Western blot和RT-qPCR技术检测Nrf2 mRNA和蛋白表达水平。6.Nrf2启动子DNA甲基化检测:根据Nrf2启动子区域Cp G岛的富集状态设计引物,利用重亚硫酸盐测序（Bisulfite sequencing PCR,BSP）分析Nrf2启动子DNA甲基化水平。6.统计分析:差异miRNAs KEGG通路使用DIANA miRPath v.3进行统计分析。BSP结果使用R语言进行矩阵2×2统计分析。Western blot、RT-qPCR和ELISA实验结果使用GraphPad Prism 6.0进行统计分析,数据表示为平均值±标准偏差（SD）,两组比较采用Student’t检验,多组比较采用单因素方差分析。结果:1.发育期砷暴露小鼠肝脏中有86个差异表达miRNAs,其中上调miRNAs 55个,下调miRNAs 31个。显著上调的miRNA为miR-192-5p和miR-21a-5p,显著下调的miRNA为miR-7083-5p和miR-7052-5p。2.使用DIANA miRPath v.3来确定可能涉及差异miRNA的KEGG途径,其中10项具有显著差异。显著差异的前4位KEGG通路分别为脂肪酸生物合成途径、ECM受体相互作用、粘蛋白型O-聚糖生物合成和脂肪酸代谢途径。3.发育期砷暴露组与对照组小鼠肝脏中5-甲基胞嘧啶含量发现,与对照组小鼠相比,砷暴露组小鼠肝脏5m C%含量差异无显著统计学意义。4.与对照组相比,砷暴露组小鼠肝脏DNMT1蛋白水平升高,且差异具有统计学意义（P<0.05）,但其mRNA水平在两组间差异无统计学意义;DNMT3a和DNMT3b的mRNA和蛋白水平在砷暴露组与对照组间差异均无统计学意义;Tet1、Tet2、Tet3的mRNA水平在砷暴露组无显著差异。5.发育期砷暴露引起Nrf2 mRNA和蛋白表达升高。6.对照组小鼠肝脏中Nrf2启动子区域DNA甲基化率为1.7%,发育期砷暴露组小鼠肝脏中Nrf2启动子区域DNA甲基化率为0.9%,但两组间差异无统计学意义（P=0.065）。结论:1.发育期砷暴露引起断乳小鼠肝脏中miRNA表达谱的变化,通过KEGG分析富集出10条具有显著差异的信号通路。2.发育期砷暴露促进DNMT1表达,发现全基因组DNA甲基化水平未发生明显变化。3.发育期砷暴露诱导Nrf2表达升高,但未对其启动子区域DNA甲基化水平产生显著影响。
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